Protein fordøyelse, ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi å optimalisere isolering av Exosomes fra menneskelig blod Plasma og Serum
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å rense exosomes fra både plasma og serum med redusert co rensing av ikke-exosomal Blodproteiner. Optimalisert protokollen inneholder ultrafiltrasjon, protease behandling og størrelse utelukkelse kromatografi. Forbedret rensing av exosomes fordelene nedstrøms analyser, inkludert mer nøyaktig kvantifisering av blemmer og proteomic karakterisering.
Abstract
Exosomes, en slags nanovesicle fra alle celletyper, kan isoleres fra alle kroppslige væske. Innholdet i exosomes, inkludert proteiner og RNAs, er unike for cellene som de er avledet og kan brukes som indikatorer på sykdommen. Flere felles berikelse protokoller, inkludert ultracentrifugation, gi exosomes med løselig protein forurensninger. Spesielt, har vi funnet at de mest tallrike proteinene i blod ofte co renser med exosomes og kan forvirre nedstrøms proteomic studier, ødela identifikasjon av lav overflod biomarkør kandidater. Av ekstra bekymring er irreproducibility av exosome protein kvantifisering på grunn av inkonsekvent representasjon av ikke-exosomal protein nivå. Protokollen finnesher ble utviklet for å fjerne ikke-exosomal proteiner som co renser sammen med exosomes, legge rigor til en exosome renselsesprosess. Fem måter ble sammenlignet med sammenkoblede blod plasma og serum fra fem givere. Analyse bruker hydrogenion analyse og mikro bicinchoninic syre protein analysen viste at en kombinert protokoll utnytte ultrafiltrasjon og størrelse utelukkelse kromatografi gitt den optimale vesicle berikelse og løselig protein fjerning. Vestlige blotting ble brukt til å bekrefte at de forventede rikelig blod proteinene, inkludert albumin og apolipoproteins, var oppbrukt.
Introduction
Exosomes er nanovesicles (varierer i størrelse fra 30 nm til 150 nm) utgitt av nesten alle cellene i kroppen å forenkle celle til celle kommunikasjonen prosesser1,2. Interessant, sammensetningen av exosomes endres cellene opprinnelsesland samt helsetilstanden til individuelle3,4,5. I tillegg exosomes kan hentes fra flere biologiske væsker som: spytt, urin og blood2. På grunn av disse funksjonene anses exosomes å være en god kilde til sykdom biomarkers. Dessverre, det finnes ingen standard metode for isolering av exosomes. Noen laboratorier vurdere må sentrifugering, med en siste høyhastighets trinnet på 100.000 x g bruker tetthet forløpninger som gull standard metode for exosome isolasjon. Men har nyere studier vist at ultracentrifugation induserer samling av exosomes med løselig proteiner og andre exosomes, i tillegg til påvirker exosome integritet, begge kan hemme nedstrøms programmer6,7 . Andre vanlige metoder for exosome isolasjon inkluderer, men er ikke begrenset til: nedbør av kommersielle polyetylenglykol (PEG) basert reagenser, sentrifugal ultrafiltrasjon og størrelse-utestenging kromatografi (SEC). Kommersielle reagenser med polyetylenglykol (PEG) polymerer berike exosomes av forårsaker dem til å utløse og danne pellets. Begrensninger ved hjelp av dette polymer er forurensning med gjenværende PEG polymer og en overflod av løselig ikke-exosomal proteiner i sluttproduktet. Ultrafiltrasjon benytter sentrifugering å rense og konsentrere blemmer med en cellulose membran; exosomes beholdes over filteret, mens mindre urenheter og andre proteiner går gjennom membranen7,8. Akkurat som andre metoder har sentrifugal ultrafiltrasjon begrenset kapasitet til å rense exosomes på grunn av oppbevaring av høye nivåer av ikke-exosomal proteiner, inkludert protein komplekser og aggregat. Til slutt bruker SEC rensing porøse harpiks skille molekyler av størrelse. SEC har vist lovende resultater, overvinne de fleste problemene erfarne med andre metoder av fanger flertallet av miljøgifter proteiner og bevare exosomal integritet, siden isolasjon er basert på tyngdekraften eller lavt trykk systemer7, 9. Imidlertid påvirker co isolering av større protein aggregater og lipoproteiner10 under SEC renheten av siste exosome utarbeidelse. Mens noen metoder har blitt testet for exosome rensing fra celle kultur supernatants og plasma7eller bare plasma9,11, er det ingen informasjon om resultatene av metoder for direkte sammenligne blod plasma og serum fra samme individ.
Her fokusere vi på rensing av blod exosomes ved å sammenligne en rekke arbeidsflyter for å finne ut om vesicle berikelse teknikker er oversettbare mellom plasma og serum. Hydrogenion analyse og western blot ble brukt om å kvantifisere forskjellene i exosome konsentrasjon, renhet og protein komposisjon i slutten produkter. Siste metoden beskrevet i denne protokollen, øker vesicle tall og reduserer ikke-exosomal protein nivå. Viktigst, er en drastisk reduksjon av felles co fremskynde proteiner inkludert albumin og apolipoproteins demonstrert. Høy overflod av disse to proteinene i blodet og frekvensen som de co renser med exosomes forårsaker inkonsekvenser mellom “renset” eksempler, forvrenger nedstrøms analysene. Denne protokollen inkluderer bruk av en kommersielt tilgjengelig SEC harpiks; harpiks består av porøse perler der proteiner mindre enn 700 kDa kan angi perler. En gang inne, proteiner beholdes av en octylamine ligand. Eluate består av exosomes og molekyler større enn 700 kDa12. I tillegg for å redusere protein Aggregatene og apolipoproteins som unngå perle overlapping, inkluderer vi en protease fordøyelsen trinn i arbeidsflyten. Det er foreløpig ingen enkelt teknikk i stand til å maksimere exosome avkastning samtidig redusere co rensing ikke-exosomal proteiner. Denne studien viser at en rensing protokoll som kombinerer en protease fordøyelsen forbehandling med flere gjenvinnings- og renseutstyr metoder kan brukes å øke exosome avkastning og renhet fra blod serum og plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
En optimalisert metode for å øke renhet og avkastning på exosomes fra blod vil øke evnen til å nøyaktig min ekstracellulære blemmer som biomarkers for flere sykdommer. Standard metodene som brukes til å isolere exosomes, spesielt ultracentrifugation og nedbør metoder, har flere ulemper inkludert exosome aggregering og pelleting av løselig proteiner7,17, 18. Alternativt, bruk av SEC har vist en betydelig forbedring i e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskningen ble støttet av interne penger fra CSU (til KMD), ATCC kontrakt #2016-0550-0002 (en sub av NIAID HHSN272201600013C), og The Bill og Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (til KMD/NKG). Vi takker NSF forskning opplevelsen for studenter (REU) sommerprogram ved Colorado State University for ytterligere støtte.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
