Protein matsmältningen, ultrafiltrering och storlek utslagning kromatografi att optimera isolering av Exosomes från mänsklig blodplasma och Serum
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att rena exosomes från både plasma och serum med minskad Co rening av icke-exosomal blodproteiner. Optimerad protokollet innehåller ultrafiltrering, proteas behandling och storlek utslagning kromatografi. Förbättrad rening av exosomes fördelar nedströms analyser, inklusive mer exakt kvantifiering av blåsor och proteomiska karakterisering.
Abstract
Exosomes, en typ av nanovesicle som släppt från alla celltyper, kan isoleras från alla kroppsliga vätskor. Innehållet i exosomes, inklusive proteiner och RNAs, är unika för cellerna från vilken de härrör och kan användas som indikatorer på sjukdom. Flera gemensamma anrikning protokoll, inklusive ultracentrifugering, ge exosomes lastad med lösligt protein föroreningar. Specifikt, har vi funnit att de vanligast förekommande proteinerna i blodet ofta samtidig rena med exosomes och kan förvirra nedströms proteomiska studier, omintetgörs identifiering av låg överflöd biomarkör kandidater. Är irreproducibility av exosome protein kvantifiering på grund av inkonsekventa representation av icke-exosomal proteinnivåer ytterligare oroande. Protokollet beskrivs här utvecklades för att ta bort icke-exosomal proteiner som tillsammans renar tillsammans med exosomes, lägga till stringens till exosome reningsprocessen. Fem metoder jämfördes med hjälp av ihopkopplade blod plasma och serum från fem givare. Analys med nanopartiklar spårning analys och mikro bicinchoninic acid protein analysen avslöjade att ett kombinerat protokoll utnyttja ultrafiltrering och storlek utslagning kromatografi gav för optimal vesikler anrikning och lösligt protein borttagning. Western blotting användes för att kontrollera att de förvänta riklig blodproteiner, inklusive albumin och apolipoproteiner, tömdes.
Introduction
Exosomes är nanovesicles (varierar i storlek från 30 nm till 150 nm) släpptes av nästan alla celler i människokroppen att underlätta cell-till-cell kommunikation bearbetar1,2. Intressant, sammansättningen av exosomes ändras beroende på cellerna i ursprung liksom hälsotillståndet hos den enskilda3,4,5. Dessutom kan exosomes hämtas från flera biologiska vätskor såsom: saliv, urin och blod2. På grund av dessa funktioner anses exosomes vara en bra källa av sjukdom biomarkörer. Tyvärr finns det ingen standard metod för isolering av exosomes. Vissa laboratorier anser utgångsämnet centrifugering, med ett sista snabba steg på 100 000 x g använder täthetlutningar som guldmyntfoten metod för exosome isolering. Senare studier har dock visat att ultracentrifugering inducerar aggregering av exosomes med lösliga proteiner och andra exosomes, förutom som påverkar exosome integritet, vilka båda kan hämma nedströms tillämpningar6,7 . Andra vanliga metoder för exosome isolering inkluderar, men begränsas inte till: fällning av kommersiella polyetylenglykol (PEG) baserat reagenser, centrifugal ultrafiltrering och storlek-utslagning kromatografi (SEC). De kommersiella reagenser med polyetylenglykol (PEG) polymerer berika exosomes genom att orsaka dem att fällningen och bilda en pellet. Begränsningar med denna polymer är kontamination med kvarstående PEG polymer och ett överflöd av icke-exosomal av lösliga proteiner i slutprodukten. Ultrafiltrering använder tredjeparts centrifugering för att rena och koncentrera blåsor med en cellulosa membran; exosomes finns kvar ovanför filtret, medan mindre orenheter och andra proteiner passerar genom membranet7,8. Precis som andra metoder har centrifugal ultrafiltrering en begränsad kapacitet att rena exosomes på grund av bibehållandet av höga nivåer av icke-exosomal proteiner, inklusive proteinkomplex och mängder. Slutligen använder SEC rening porösa harts för att separera molekyler av storlek. SEC har visat lovande resultat, att övervinna de flesta av problem som är erfarna med andra metoder genom att fånga flesta främmande proteiner och bevara exosomal integritet, eftersom isolering är baserad på gravitation eller lågtryck system7, 9. Dock påverkar större protein aggregat och lipoproteiner10 samtidig isolering under SEC renheten av den slutliga exosome beredningen. Medan vissa metoder har testats för exosome rening från cell cellkulturer och plasma7eller endast plasma9,11, finns det ingen information om prestanda för metoder direkt jämföra blod plasma och serum från samma individ.
Här fokuserar vi på rening av blod exosomes genom att jämföra en mängd arbetsflöden att avgöra om vesikler anrikning tekniker är översättningsbara mellan plasma och serum. Nanopartiklar spårning analys och western blot har använts för att kvantifiera skillnaderna i exosome koncentration, renhet och protein sammansättningen i slutprodukter. Den sista metoden, som beskrivs i detta protokoll, ökar vesikelprotein siffror och minskar icke-exosomal proteinnivåer. Ännu viktigare, demonstreras en drastisk minskning av gemensamma samtidig fällning proteiner inklusive albumin och apolipoproteiner. Hög överflödet av dessa två proteiner i blodet och frekvensen vid vilken de Co rena med exosomes orsakar inkonsekvenser mellan ”renat” prover, skevning nedströms analyserna. Detta protokoll innefattar användning av en kommersiellt tillgänglig SEC harts; Hartset utgörs av porösa pärlor där proteiner mindre än 700 kDa kan ange pärlorna. En gång inuti, proteinerna behålls av en octylamine-ligand. Eluatet är sammansatt av exosomes och molekyler större än 700 kDa12. Dessutom, för att minska protein aggregat och apolipoproteiner som undgå pärla svällning, inkluderar vi ett proteas matsmältningen steg i arbetsflödet. För närvarande finns det ingen enda teknik kan maximera exosome kapacitet samtidigt minska Co renande icke-exosomal proteiner. Denna studie visar att en rening-protokollet som kombinerar ett proteas matsmältningen förbehandling med flera metoder för återvinning och rening kan användas för att öka exosome avkastning och renhet från blod serum och plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
En optimerad metod för att öka renhet och avkastningen av exosomes från blod kommer att öka förmågan att korrekt gruvan extracellulära blåsor som en källa av biomarkörer för flera sjukdomar. De standardmetoder som används för att isolera exosomes, specifikt, ultracentrifugering och nederbörd metoder, har flera nackdelar inklusive exosome aggregation och pelletering av lösliga proteiner7,17, 18. Alternativt, anvä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöds av interna medel från CSU (till KMD), ATCC kontrakt nr 2016-0550-0002 (underleveranser av NIAID HHSN272201600013C), och The Bill och Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (till KMD/NKG). Vi tackar NSF forskning upplevelsen för studenter (GRO) sommarprogram vid Colorado State University för ytterligare support.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
