Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle
Summary
Burada, proteaz özgüllük ham fare doku belirlemek için bir protokol MALDI-TOF spektrometresi kullanılarak özleri mevcut.
Abstract
Proteaz protein harekete geçirmek/inactivation ve gıda sindirimi de dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyonları var. Proteaz özgüllük tanımlayan proteaz işlevi ifşa için önemlidir. Bu çalışmada önerilen yöntem matris yardımlı Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma kullanarak benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçerek proteaz özgüllüğü belirler saat uçuş (MALDI-TOF) kütle spektrometresi. Cleaved site amino asitleri oluşur ve boşluk Ekleyici Polietilen glikol oluşur yüzeylerde iminobiotin, içerir. Cleaved substrat cleaved bir amino asit kullanarak benzersiz bir moleküler ağırlığı oluşturur. Bu yöntem yararları bu ham numuneleri kullanılarak bir tencereye yürütülen ve aynı zamanda birden fazla örnekleri değerlendirmek için uygundur biridir. Bu makalede, biz basit bir deneysel Yöntem doku çıkarma, sindirim yüzeylerde yerleşimini farklı pH koşullarında sindirim yüzeylerde arıtma örnekleri, içine dahil olmak üzere fare akciğer dokusundan elde örnekleri ile optimize tarif ve yüzeylerde moleküler ağırlık MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak ölçümü. Özet olarak, bu teknik proteaz özgüllük ham örneklerinde kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak doku özleri elde tanımlanması için izin verir.
Introduction
Proteaz proteinler fizyon tarafından fizyolojik süreçleri düzenleyen ve belirli zamanlarda ve yerlerde proteaz aktivitesinin başlangıcında düzenlenmiş1. Bu nedenle ifade ve yerel olarak düzenlenmiştir dokuların aktivite tanımlama ve proteaz algılamak için yeni bir yöntem geliştirmek için önemlidir. Önerilen yöntem bu çalışma proteaz özgüllük proteaz tespit için paralel olarak tanımlamak amaçlamaktadır.
Proteaz özgüllük algılamak için bazı yöntemler vardır. Azocasein yönteminin kullanımı ile proteaz2 algılanması için iyi bilinen ama onun yetenek daha fazla bilgi almak için sınırlıdır. Zymography, proteaz3molekül ağırlığı belirlemek için kullanılan başka bir kapsamlı proteaz algılama yöntemi olmakla birlikte, substrat özgüllüğü incelemek için kullanılamaz. Proteaz özgüllük spektrometrik deneyleri, p-nitroanilide4gibi yüzeylerde kullanarak ve Fluorometrik deneyleri, coumarin yüzeylerde5 veya floresan rezonans enerji transferi (FRET) deneyleri6kullanarak tarafından belirlenebilir. Bu yöntemler tek bir kuyuda bulunan yüzeylerde tek-özgüllük algılanmasını etkinleştirin. Bu özler birden çok proteaz içeren çalışmanın, doku özleri proteaz özgüllük çeşitli koşullar altında incelenir. Proteaz aktivitesi pH, koenzimler, prostetik gruplar ve iyon gücü de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından düzenlenmiştir. Son zamanlarda, proteomik tabanlı yöntemleri proteaz özgüllük tanımlamak için kullanılmıştır; Örneğin, Biniossek ve arktarafından bildirilen yöntemi. 7 Proteom substrat özgüllüğü bile içinde ham özleri belirlemek için kullanır ve birden çok amino asit dizileri8tanımak proteaz bölünme etkinliğinin doğru belirlenmesi sağlar. Ancak, bu yöntem çok sayıda örnekleri analiz için uygun değildir. Buna ek olarak, bizim Yöntem birden çok örneği aynı anda işleme ve kullanım Matrix-Assisted Lazer Desorpsiyon/iyonlaşma sağlar saat uçuş (MALDI-TOF) örnek analiz için kütle spektrometresi i ciddi, hızlı ve kolay algılama kolaylaştırır yüzeylerde.
Bu kağıt proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde molekül ağırlığı ölçmek için MALDI-TOF Kütle spektrometresi kullanılarak değerlendirmek için bir yöntem özetliyor. Onların kuramsal moleküler ağırlıkları birlikte i ciddi yüzeylerde moleküler formları Şekil 1 ve Tablo 1‘ de gösterilmiştir. Önceki çalışmalarda polyglycine çubukları ve biotin9içeren yüzeylerde kullanılan; Ancak, polyglycine sıra glisin sıra tanımak enzimler tarafından i ciddi çünkü bu yüzeylerde hatalı. Ayrıca, yüksek afinite avidin ve biotin arasında düşük kurtarma oranı için neden olabilir. Polietilen glikol (PEG), iminobiotin ve bölünme sitesi (Şekil 1) teşhis edebilecek bir amino asit oluşan benzersiz bir substrat sentezlenmiş Bu çalışmada bu sakıncaları üzerine geliştirmek için. Benzer moleküler ağırlık amino asitler arasında ayırımcılık için D-serin PEG spacer ve amino asit cleaved sitesinde arasında eklendi.
N-terminal substrat, benzeşim arıtma ham örneklerinden sağlayan iminobiotin ile etiketli oldu. İminobiotin yerine biotin kullanımı önemlidir; biotin avidin avidin için iminobiotin’ın ilgi pH tarafından değiştirilebilir iken hangi biotin etiketli yüzeylerde avidin reçine, düşük oranda düşük kurtarma sonuçlar ile güçlü bir ilgi vardır. İminobiotin etiketli yüzeylerde pH 4 aşağıdaki koşullarda avidin bültenleri iken Iminobiotin etiketli yüzeylerde avidin pH 9, yukarıdaki koşullarda bağlayacaksınız. Bu nedenle, iminobiotin benzeşme arıtma10için kullanıldı. Özetle, biz proteaz özgüllük benzersiz yüzeylerde kullanarak tespit için detaylı bir protokol tanımlamak.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı MALDI-TOF Kütle spektrometresi proteaz özgüllük doku özler elde edilen ham örneklerinde tanımlamak için kullanır ve kolayca birden çok örnek işleme için ölçekli. Özellikle, pH substrat özgüllüğü bir değişiklik neden manipüle.
Yaygın Biyokimya onun bağlama özgüllüğü nedeniyle kullanılmıştır, avidin-biotin karmaşık (ABC) yöntemi, bizim iletişim kuralında kullanılmıştır. ABC güçlü yakınlığı nedeniyle, avidin biotin için bağ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen Nihon ilaç Üniversitesi Araştırma Bursu Nihon ilaç Üniversitesi (2016) ve MEXT KAKENHI Grant numarası JP17854179 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
References
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
