CAIRP-Seq et ChIP-Seq : méthodes pour identifier les ARN associée à la chromatine et Interactions protéine-ADN dans les cellules souches embryonnaires

Résumé

Ici, nous décrivons des méthodes pour effectuer des ChIP-Seq et cartes de CAIRP-Seq, y compris la préparation de la bibliothèque pour l’ordonnancement de nouvelle génération, pour générer l’épigénomique global et l’ARN associée à la chromatine dans les cellules ES.

Résumé

Auto-renouvellement des cellules souches embryonnaires (ES) et de différenciation est régie par des signaux extrinsèques et intrinsèques réseaux de facteurs de transcription, régulateurs épigénétiques et traduction après modification des histones qui combinatoirement influent sur le gène État d’expression des gènes voisins. RNA a également été montré pour interagir avec diverses protéines pour réguler la dynamique de la chromatine et expression du gène. Immunoprécipitation de RNA associées à la chromatine (CAIRP) suivie de la nouvelle génération séquençage (CAIRP-Seq) est une nouvelle méthode pour sonder l’ARN associée à des protéines de la chromatine, tandis que de l’immunoprécipitation de la chromatine suivie par séquençage de prochaine génération ( ChIP-Seq) est une technique puissante de génomique pour mapper l’emplacement du post-traductionnelles des histones, facteurs de transcription et épigénétiques modificateurs à l’échelle mondiale-dans les cellules ES. Nous décrivons ici les méthodes pour exécuter CAIRP-Seq et ChIP-Seq, y compris la construction de la bibliothèque de SEQUENÇAGE de nouvelle génération, pour générer des global associées à la chromatine RNA et épigénomique cartes dans les cellules ES.

Introduction

Décisions de devenir cellules souches embryonnaires (ES) sont réglementées par la communication entre des signaux extracellulaires et une foule de régulateurs transcriptionnels, y compris les modificateurs d’histone et traduction après modification des queues d’histone. Ces interactions facilitent l’accessibilité de la chromatine et l’emballage de la chromatine dans l’un des deux États : euchromatine, qui est ouvert et transcriptionally actif, et l’hétérochromatine, qui est compact et généralement transcriptionnellement inactif. Facteurs de transcription et les affinités de liaison de séquence spécifique d’ADN modificateurs épigénétique associé régions euchromatiques ....

Protocole

1. culture de souris ES cellules dans des Conditions sans chargeur.

NOTE : Souris ES cellules sont traditionnellement cultivées dans les médias sur une boîte de Petri de cellule recouverte de gélatine et un mono-couche de fibroblastes embryonnaires de souris (force expéditionnaire des marines), qui ont été mitotically inactivés (iMEFs). Toutefois, les MEFs doivent être retirés avant les analyses épigénétiques ou expression en aval pour éviter la contamination de la chromatine associées à MEF et de l’ARN.

1. Préparation d’une couche de conducteur : gélatine recouvrir une plaque de culture de cellules de 6 puits en ajoutant 2 mL de 0,1....

Résultats

Nous avons interrogé avec succès la liaison pangénomique du H3K4me3, H3K4me2 et KDM5B dans les cellules ES ce ChIP-Seq protocole⁶. ES cellules ont été cultivées dans des conditions sans chargeur (Figure 1) et réticulé comme décrit ci-dessus. Sonication a été effectuée tel que décrit à l’étape 3.2 du protocole ChIP-Seq et évalués par l’ADN en cours d’exécution sur un gel d’agarose à 2 % (Figure 2). Ensuite,.......

Discussion

ChIP-Seq est une méthode utile pour évaluer l’emplacement des interactions protéine-ADN global (e.g., facteurs de transcription/histone modifiant les modifications d’enzymes/histone et l’ADN) dans les cellules ES, tandis que le protocole de CAIRP-Seq nouvellement développé est utile dans interroger l’association génome d’ARN avec des constituants de la chromatine. ChIP-Seq est un outil fondamental qui sert à évaluer les paysages épigénétiques des cellules ES et autres types de cellules. La qualité de ChIP-Seq et.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Facteur inhibiteur de la leucémie de souris (ESGRO LIF)	EMD Millipore		106 or 107 units
GSK3&beta ; inhibiteur CHIR99021 (GSK3i)	Stemgent		: DMSO 10mM
inhibiteur de MEK PD0325901 (MEKi)	Stemgent		: DMSO 10mM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), glucose élevé	Invitrogen	11965092
PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	Invitrogen	10010031
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénol	Gibco	25200056
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Gibco	15140122
2-Mercaptoéthanol (50 mM)	Solution	d’acides
MEM (100X)	Gibco	11140076
EmbryoMax ES Sérum de veau fœtal qualifié pour les cellules, 500 ml	EMD Millipore	ES-009-B
EmbryoMax 0,1 % Solution de gélatine	EMD Millipore	ES-006-B
Glycine	Sigma	G7126-500G	1,25 M de stock de conentration dans l’eau
Solution de formaldéhyde	Sigma	F8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8,0 1X	Qualité Biologique	351-011-131
Solution de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)	Sigma	93482-250ML-F
cOmplete Inhibitor Cocktail	Roche	11697498001
Sodium dodecyl sulfate solution (20 %)	Qualité Biologique	A611-0837-10
Q125 sonifier	Qsonica	4422
Triton X-100 solution	Sigma	93443-100ML
Désoxycholate de sodium	Sigma	30970
NaCl	Sigma	S7653
Dynabeads Protéine G pour l’immunoprécipitation	Invitrogen	10004D
Dynabeads Protéine A pour l’immunoprécipitation	Invitrogen	10002D
Dynabeads Protéine A/Protéine G et Magnet Starter Pack	Invitrogen	10015D
lithium	Sigma	L4408
IGEPAL CA-630	Sigma	I8896
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Dynabeads Kit de purification de l’ARNm (pour la purification de l’ARNm à partir de préparations d’ARN totales)	Invitrogen	61006
SuperScript Synthèse d’ADNc double brin Kit	Invitrogen	11917010
QIAquick Kit de Purification PCR	Qiagen	28104
End-It DNA End-Repair Kit	Lucigen	ER81050
Klenow Fragment (3'&rarr ; 5' exo-)	NEB	M0212L
dATP (10 mM)	Invitrogen	18252015
T4 DNA ligase	NEB	M0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder	Invitrogen	10488085
E-gel EX gels d’agarose, 2 %	Invitrogen	G402002
Phusion master-mix haute fidélité 2X avec tampon HF	Thermo Fisher
ChIPAb+ Triméthyl-Histone H3 (Lys4) - Anticorps validé ChIP	Anticorps EMD Millipore	17-614
Anticorps anti-histone H3 (di méthyl K4) [Y47] - Grade ChIP (ab32356)	Abcam	ab32356
Plaques de culture cellulaire à fond plat Corning Costar (6 puits)
Falcon (10cm)	Fisher	08772E
Bioruptor pico	Diagenode	B01010001
Qubit Flurometer 2.0	Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher	Q32851
MinElute Reaction Cleanup Kit	Qiagen	28204
MinElute Gel Extraction	Qiagen	28604
Anti-Histone H4 (tri méthyl K20) anticorps - ChIP Grade (ab9053)	Abcam	ab9053
Rotateur Labquake	Thermo Fisher	400110Q
Plateforme Illumina HiSeq Illumina
TURBO DNase	Invitrogen	AM2238

Solvant Solvant aminés non essentiels Gibco 31350010 Chlorure de F531LPMBoîtes de culture tissulaire standard Fisher 720083 Kit