उंनमनी Auris लंग्स वोल्टेज क्लैंप शर्तों के तहत स्तनधारी Neuromuscular ट्रांसमिशन की परीक्षा के लिए तैयारी
Summary
इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल माउस का उपयोग करता है उंनमनी auris लंग्स (लाल) मांसपेशी को रिकॉर्ड करने के लिए सहज और तंत्रिका पैदा की postsynaptic क्षमता (वर्तमान दबाना) और धाराओं (वोल्टेज-दबाना) neuromuscular जंक्शन पर. इस तकनीक का उपयोग सामांय और रोग की स्थिति के तहत synaptic संचरण के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल के लिए एक तकनीक का वर्णन के तहत neuromuscular जंक्शन से synaptic संचरण रिकॉर्ड वर्तमान दबाना और वोल्टेज-क्लैंप शर्तों । उंनमनी auris लंग्स (लाल) की एक पूर्व vivo तैयारी का प्रयोग किया जाता है, क्योंकि यह एक पतली मांसपेशी कि मोटर microelectrode में endplate के लिए neuromuscular जंक्शन के आसान दृश्य प्रदान करता है । इस विधि सहज लघु endplate क्षमता और धाराओं की रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है (mEPPs और mEPCs), तंत्रिका पैदा की endplate क्षमता और धाराओं (EPPs और ईपीसी), साथ ही मोटर endplate के झिल्ली गुण. इस विधि से प्राप्त परिणाम quantal सामग्री (QC), पुटिका रिलीज साइटों की संख्या (n), पुटिका रिहाई (पीरिलायंस एनर्जी), synaptic सुविधा और अवसाद की संभावना, साथ ही मांसपेशी झिल्ली समय लगातार (τ शामिल m) और इनपुट प्रतिरोध । मानव रोग के माउस मॉडल के लिए इस तकनीक के आवेदन रोग राज्यों में प्रमुख विकृतियों को उजागर कर सकते हैं और उपंयास उपचार रणनीतियों की पहचान में मदद । पूरी तरह से वोल्टेज-एक एकल synapse clamping द्वारा, इस विधि वर्तमान में उपलब्ध synaptic संचरण का सबसे विस्तृत विश्लेषण में से एक प्रदान करता है ।
Introduction
neuromuscular जंक्शन पर synaptic ट्रांसमिशन का अध्ययन तंत्रिका और कंकाल पेशी प्रणालियों के बीच गतिशील रिश्ते में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और synaptic फिजियोलॉजी की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है । उंनमनी auris लंग्स (लाल) एक पतली मांसपेशी है, neuromuscular जंक्शनों के लिए अनुमति देता है आसानी से visualized । पिछले रिपोर्टों synaptic दवाओं और विषाक्त पदार्थों की जांच करने के लिए लाल का उपयोग करने की सुविधा का वर्णन किया है और लाल1,2के कंकाल मांसपेशी फाइबर प्रकार विशेषताओं की विशेषता है । कई अध्ययनों से लाल neuromuscular फिजियोलॉजी3,4,5,6,7,8की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया है । इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए, आसानी से लाल neuromuscular जंक्शनों का निरीक्षण करने की क्षमता मोटर endplate में microelectrodes के सटीक स्थान के लिए अनुमति देता है और बहुत synaptic संचरण रिकॉर्डिंग में अंतरिक्ष दबाना मुद्दों को कम कर देती है । मांसपेशी झिल्ली गुण की वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग, जैसे झिल्ली समय स्थिरांक (τm) और इनपुट प्रतिरोध (Rin) आसानी से प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, इन संपत्तियों एक ही मांसपेशी neuromuscular संचरण रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया फाइबर से मापा जा सकता है, synaptic समारोह की मांसपेशी झिल्ली संपत्तियों के लिए एक सीधी तुलना के लिए अनुमति देता है । इन आंकड़ों का विश्लेषण कई neuromuscular रोगों और बदल गतिविधि के राज्यों के भौतिक तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं ।
तकनीक का एक महत्वपूर्ण पहलू यहां वर्णित वोल्टेज का उपयोग है-synaptic रिकॉर्डिंग के लिए दबाना, जो गैर के अधीन नहीं है रैखिकता वर्तमान दबाना में सामना करना पड़ा और मांसपेशियों की झिल्ली गुणों से स्वतंत्र हैं । वोल्टेज का उपयोग करने के लाभ के रूप में वर्तमान-दबाना neuromuscular संचरण की जांच के लिए विरोध दबाना 1950 के दशक में अग्रणी प्रयासों द्वारा स्थापित किया गया था9। के तहत वर्तमान दबाना, EPPs कि 10-15 से अधिक है एमवी आयाम में mEPP आयाम के एक रैखिक उत्पाद नहीं है9। उदाहरण के लिए, यदि औसत mEPP है 1 mv, 5 mv की एक EPP के उत्पाद के लिए माना जा सकता 5 mEPPs (QC of 5); जबकि, ४० एमवी का एक EPP ४० से अधिक mEPPs का उत्पाद होगा । इस गैर बड़ा EPPs में रैखिकता होता है क्योंकि EPP, जो acetylcholine रिसेप्टर (~-10 एमवी) के लिए झिल्ली की क्षमता और संतुलन क्षमता के बीच अंतर है के लिए ड्राइविंग बल, काफी बड़ी EPPs के दौरान कम हो जाती है । स्नायु झिल्ली क्षमता वोल्टेज दबाना प्रयोगों के दौरान परिवर्तन नहीं करता है, क्योंकि यह समस्या वोल्टेज दबाना प्रयोगों में बचा है । एक खामी यह है कि वोल्टेज दबाना प्रयोगों तकनीकी रूप से और अधिक मुश्किल वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग से पूरा करने के लिए कर रहे हैं । मन में इस के साथ, McLachlan और मार्टिन एक सीधा गणितीय सुधार है कि गैर के लिए खातों में वर्तमान में रैखिकता-EPPs10की रिकॉर्डिंग दबाना विकसित । सुधार अच्छी तरह से काम11,12,13, लेकिन महत्वपूर्ण बात यह है कि मांसपेशी झिल्ली गुण बाधित नहीं किया गया है मान ।
मांसपेशी झिल्ली गुण विशेष रूप से अगर स्थितियों या रोग राज्यों है कि मांसपेशियों को बाधित अध्ययन पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । उदाहरण के लिए, Huntington रोग के R6/2 ट्रांसजेनिक मॉडल से कंकाल की मांसपेशी आराम क्लोराइड और पोटेशियम धाराओं में एक प्रगतिशील कमी के कारण hyperexcitable है14,15. एक परिणाम के रूप में, mEPPs और EPPs R6/2 कंकाल की मांसपेशी में परिलक्षित कर रहे हैं । निश्चित रूप से, अतिरिक्त कारकों mEPPs और EPPs बदल सकते हैं । Huntington की बीमारी चूहों के एक अलग मॉडल के साथ काम (R6/EPPs में परिवर्तन पाया गया है कि जाल प्रोटीन से संबंधित लग रहा था8। बदल neuromuscular संचरण के कारण तंत्र का आकलन करने के लिए, यह एक वोल्टेज-दबाना का उपयोग करके बदल मांसपेशी झिल्ली संपत्तियों के प्रभाव को खत्म करने के लिए फायदेमंद होगा । हाल के एक अध्ययन में, R6/2 neuromuscular संचरण दोनों वर्तमान और वोल्टेज-क्लैंप शर्तों के तहत अध्ययन किया गया था यहां वर्णित तकनीक का उपयोग कर । मोटर endplates की पूरी तरह वोल्टेज थे-से कम 1% त्रुटि के साथ clamped endplate की लंबाई स्थिरांक के भीतर दो microelectrodes रखकर16। यह दिखाया गया है कि वोल्टेज-दबाना और सही वर्तमान दबाना रिकॉर्ड R6 में neuromuscular संचरण के विषम माप उपज/ यह प्रकाश डाला गया कि यह गैर के लिए EPPs सही करने के लिए मुश्किल हो सकता है रैखिकता अगर मांसपेशी झिल्ली गुण बदल दिया गया है और वोल्टेज दबाना रिकॉर्ड है कि मांसपेशियों की झिल्ली गुणों से स्वतंत्र हैं प्राप्त करने के लाभों से पता चलता है. यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल की स्थिति या रोग राज्यों है कि synaptic संचरण और postsynaptic झिल्ली संपत्तियों को प्रभावित की जांच के लिए आदर्श है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित है तैयारी और वर्तमान या वोल्टेज-दबाना शर्तों के तहत neuromuscular संचरण की माप के लिए माउस लाल मांसपेशी का उपयोग करें । लाल को बाहर निकालने के लिए विचार करने के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं । इलेक्ट्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम संपादकीय टिप्पणी के लिए डॉ मार्क एम रिच और डैनियल मिरांडा धंयवाद, इस तकनीक की स्थापना में मदद करने के लिए अहमद Khedraki, और राइट राज्य विश्वविद्यालय वित्तीय सहायता के लिए (A.A.V. के लिए स्टार्टअप कोष) ।
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
References
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