Ammoniak fiber ekspansion (AFEX) er en termokemisk forbehandling teknologi, der kan konvertere lignocellulose biomasse (f.eks majs stover, ris halm, og sukkerrør bagasse) i en meget fordøjelig råvare til både biobrændstoffer og dyrefoder applikationer. Her beskriver vi en laboratorieskalametode til gennemførelse af AFEX-forbehandling på lignocellulosebiomasse.
Lignocellulosematerialer er planteafledte råmaterialer, såsom afgrøderester (f.eks. majsstover, rishalm og sukkerrørsbagasse) og formålsdyrkede energiafgrøder (f.eks. miscanthus og switchgrass), der er tilgængelige i store mængder til fremstilling af biobrændstoffer, biokemikalier og dyrefoder. Plantepolysaccharider (dvs. cellulose, hemicellulose og pektin), der er indlejret i cellevægge, er meget genstridige mod omdannelse til nyttige produkter. Ammoniak fiber ekspansion (AFEX) er en termokemisk forbehandling, der øger tilgængeligheden af polysaccharider til enzymer til hydrolyse i fermenterbare sukkerarter. Disse frigivne sukkerarter kan omdannes til brændstoffer og kemikalier i et bioraffinaderi. Her beskriver vi en laboratorie-skala batch AFEX proces til at producere forbehandlet biomasse på gram-skalaen uden ammoniak genanvendelse. Laboratorieskalaprocessen kan anvendes til at identificere optimale forbehandlingsforhold (f.eks. ammoniakbelastning, vandbelastning, biomassebelastning, temperatur, tryk, opholdstid osv.) og genererer tilstrækkelige mængder forbehandlede prøver til detaljeret fysisk-kemisk karakterisering og enzymatisk/mikrobiel analyse. Udbyttet af fermenterbart sukker fra enzymatisk hydrolyse af majsstover præbehandlet ved hjælp af laboratorieskalaen AFEX-processen kan sammenlignes med pilot-skala AFEX-processen under lignende forbehandlingsforhold. Formålet med dette dokument er at tilvejebringe en detaljeret standardprocedure for sikker og ensartet drift af laboratoriereaktorer til udførelse af AFEX-forbehandling af lignocellulosebiomasse.
Ammoniak fiber ekspansion (AFEX) er en termokemisk forbehandling, der bruger flygtige ammoniak som den vigtigste reaktant for celluloseholdig biomasse forbehandling. Denne proces blev oprindeligt opfundet af Bruce Dale for omkostningseffektivt at reducere recalcitrance af lignocellulosebiomasse og forbedre biologisk katalyseret forbehandlet biomassedekonstruktion til fermenterbar sukker1,2. I modsætning til de fleste andre vandige-baserede termokemiske forbehandlinger3, AFEX er en tør-til-tør proces, der forårsager ingen væsentlig ændring i biomasse sammensætning og kræver ingen vask skridt med sin tilhørende affaldsproduktion og omkostninger. Det er påvist, at overskydende flygtige ammoniak er blevet genfundet i pilotskalaen, hvilket resulterer i reducerede affaldsproduktions- og forarbejdningsomkostninger. Det pilot-skala pakkede BED AFEX-reaktorsystem, der er udviklet af MBI (figur 1), genvinder resterende ammoniak ved hjælp af dampstripning og overfører den varme, koncentrerede ammoniak til en ny pakket seng4,5. Efter AFEX’s forbehandling kan de mindre mængder kvælstof, der tilsættes biomassen, anvendes som ikke-proteinnitrogen af drøvtyggere og mikroorganismer. Ved at ændre biomasseultrastrukturen ved hjælp af forskellige fysisk-kemiske mekanismer6,7,8, øger AFEX desuden biomassens tilgængelighed for kulhydrataktive enzymer (CAZymes) og øger forekomsten af polysaccharider hydrolyse med flere gange8,9, hvilket også øger dens fordøjelighed af drøvtyggere via deres cellulolytiske mikrobiom4,10,11,12.12 Landmændene har længe anvendt en enklere version af denne metode for at øge fordøjeligheden af drøvtyggere foder ved at inkubere biomasse i dage eller uger under plast presenninger i overværelse af lav vandfri ammoniak belastninger (<4% w / w grundlag af tør biomasse) og omgivende tryk og temperaturer10,11.
Vandfri ammoniak blev først undersøgt for dets potentiale til at delignify træ i 1950’erne og som pulping kemikalie i begyndelsen af 1970’erne13,14,15,16,17,18. I begyndelsen af 1980’erne blev tryk, højtemperatur, koncentreret ammoniak (>30% NH4OH) under subkritiske forhold første gang brugt i Dale-laboratoriet til at forbedre den enzymatiske fordøjelighed og mikrobielle fermenterbarhed af lignocellulosebiomasse19. Denne proces gennemgik flere navneændringer i årenes løb, begyndende som ammoniak fryse eksplosion, og derefter ammoniak fiber eksplosion, og endelig, ammoniak fiber ekspansion, eller blot AFEX. Omkring samme tid (midten af slutningen af 1980’erne), DuPont (nu Dow-DuPont) også undersøgt ved hjælp af superkritiske og næsten kritiske vandfri ammoniak baseret forbehandling processer for at øge fordøjeligheden af biomasse20,21,22. I de seneste årtier har der været øget vægt på at bruge fortyndede vandige ammoniak opløsninger som en forbehandling reagens, herunder ammoniak genbruge / percolation23 (ARP), iblødsætning i vandig ammoniak (SAA), eller Dow-DuPont processen uden ammoniak genbruge24. Et par yderligere metoder har set på brugen af vandfri ammoniak (lav-fugt vandfri ammoniak (LMAA), og lav-flydende ammoniak forbehandling25 (LAA). to nye avancerede organosolv-type forbehandling teknologier udnytteflydende vandfri ammoniak26,,27 og ammoniak-salt baserede opløsninger28 ved høj væske til faste belastninger blev for nylig udviklet, der muliggør selektiv lignin fraktionering og høj effektivitet enzymatisk hydrolyse af forbehandlet cellulosebiomasse ved ultra-lav enzym belastninger. En nylig gennemgang artikel har fremhævet ligheder og tydelige forskelle mellem forskellige former for ammoniak-baserede prætreatments29. Men indtil for nylig4, var der ingen pilot-skala demonstrationer af ammoniak-baserede forbehandlingsprocesser (som AFEX), der effektivt blev kombineret med lukket kredsløb kemisk elikvie af koncentreret ammoniak, der anvendes i processen.
I dette dokument beskriver vi i detaljer den mest anvendte AFEX-protokol til at forretreate cellulosebiomasse i laboratorieskalaen for at producere gramskalaer af forbehandlet biomasse (f.eks. 1 til flere 100 g). Typisk blandes biomasse med vand (0,1-2,0 g H2O/g tør biomasse) og lastes i en specialbygget rustfri stålrør- eller parrtypereaktorer. Vandfrit ammoniak tilsættes derefter (0,3-2,0 g NH3/gtør biomasse) til reaktoren, og blandingen opvarmes til den ønskede reaktionstemperatur (60-180 °C). Tidligere publikationer om AFEX-processen fra 1980’erne-1990’erne startede opholdstiden for forbehandling (f.eks. 5-60 min. umiddelbart efter temperaturrampen. Men da reaktionerne opstår, så snart ammoniaktilen er tilsat reaktoren, skal den nuværende AFEX-procedure begynde at overvåge opholdstiden umiddelbart efter ammoniaktilsætning til reaktoren. Ved temperaturer på 90 °C eller derover er det ofte nødvendigt at forvarme biomassen, før ammoniaken læsses, for at holde den første temperaturrampe op i en minimumsperiode (dvs. Ved afslutningen af opholdstiden åbnes en ventil for hurtigt at frigøre trykket og gasfaseindholdet i en egnet kemisk røghætte. Den hurtige omdannelse af ammoniak fra flydende til gasfase får også reaktoren til at køle ned. Små reaktorer (100 ml reaktorvolumen) kan have brug for ekstra tid til afkøling. Af hensyn til brugersikkerheden anbefales det at rense med nitrogen i større skala (>100 g ammoniak pr. reaktorkørsel) for at fjerne så meget restammoniak som muligt fra beholderen og hjælpe med at køle reaktorindholdet før losning. Typisk, ingen forsøg på lab-skalaen til at genbruge og / eller inddrive ammoniak. En af de vigtigste designudfordringer i forbindelse med opskalering af AFEX’s forbehandlinghar været genanvendelse af ammoniak med minimale kapital- og driftsomkostninger. Også, tilføje flydende ammoniak til biomasse generelt drev delvis inddækning af væsken, der køler biomassen, kræver opvarmning af biomasse-ammoniak blandingen før AFEX behandling kan begynde. Snarere end at tilføje ammoniak som flydende, tilføje ammoniak damp til biomasse giver to fordele: For det første, den høje porøsitet af bulk biomasse tillader ammoniak damp, der skal transporteres hurtigt, hvilket resulterer i selv ammoniak distribution i hele biomassen. For det andet opløses ammoniakdamp let og eksotermt i vandet, der er uddannet i fugtig biomasse, hvilket resulterer i varmeproduktion, der hurtigt og jævnt opvarmer biomassen. For at udnytte disse fordele, både MSU Dale lab og MBI har udviklet AFEX behandlingsmetoder ved hjælp af ammoniak damp. Dale lab har udviklet Gaseous Ammoniak Forbehandling (GAP) proces30, og MBI har udviklet pakket seng AFEX reaktor proces (Figur 1)4, som er blevet påvist på pilotskalaen. Det pakkede AFEX-reaktorsystem er i stand til at udføre halvbatchtilstand med fuldstændig genanvendelse af ammoniak ved hjælp af en dampstripningsmetode4,5. Denne nye MBI pilot-skala proces udnytter de kemiske og fysiske egenskaber af ammoniak til effektivt at forfdrive biomasse og samtidig effektivt genanvendelse af ammoniak.
Her præsenterer vi en detaljeret skitse til gennemførelse af AFEX forbehandling af majs stover på lab-skalaen ved hjælp af specialbyggede 200 ml volumen rørformede reaktorer (Figur 2). AFEX’s forbehandlede prøver blev fordøjet til fermenterbart sukker ved hjælp af kommercielt tilgængelige cellulolytiske enzymcocktails for at påvise effekten af forbehandlingsprocesserne. Resultaterne af enzymatisk hydrolyse for AFEX-reaktoren i laboratorieskala blev sammenlignet med større afexreaktorproducerede prøver i pilotskalaskala. Vores mål er at give en standard driftsprocedure for sikker og konsekvent drift af lab-skala trykreaktorer til at udføre AFEX forbehandling på celluloseholdig biomasse som majs stover. Yderligere supplerende oplysninger om variationer i denne laboratorie-skala AFEX forbehandling proces (f.eks pilot-skala pakket seng AFEX proces) er yderligere fremhævet i den ledsagende supplerende pdf-fil. En detaljeret rapport om de pakkede afex-processer, der er i den pakkede seng, vil blive fremhævet i en separat publikation og kan rekvireres fra MBI-MSU.
AFEX-protokollen beskriver, hvordan plantematerialer behandles i nærvær af vandfri ammoniak og vand ved forhøjede temperaturer for at øge fordøjeligheden af forbehandlingsmaterialet med cellulolytiske enzymer og/eller mikrober. AFEX er meget effektiv på graminoid monocot arter (f.eks majs stover, switchgrass, miscanthus, ris halm, hvede halm, og sukkerrør bagasse) på grund af effektiviteten af processen til at kløve ester forbindelser, der er naturligt rigelige i disse materialer31. AFEX er langt mindre effektiv på biomasse stammer fra dicots og nøgenfrøede (hårdttræ, nåletræ, og indfødte forbs)32,33 på grund af den mindre andel af lignin-kulhydrat baseret ester forbindelser. Men når disse forbindelser indføres i woody cellevægge ved hjælp af plantebioteknologi, afEX forbehandling sprocessen bliver langt mere effektiv34.
Spaltning af esterforbindelser gør det muligt at fjerne visse biomassekomponenter fra materialet, men deponeres igen som ekstraktive på de ydre cellevægoverflader, hvilket resulterer i dannelsen af nanoskalahuller, der letter indtrængning og virkning af de cellulolytiske enzymer6. AFEX forbehandlet majs stover viste en omtrent 3-dobling af glukose og xylose frigivelse sats efter enzymatisk hydrolyse under høje faste stoffer betingelser i forhold til det ubehandlede materiale. Ammoniakforbehandlinger producerer også færre og langt mindre hæmmende nedbrydningsprodukter sammenlignet med fortyndet syreforbehandling35. En tidligere sammenligning af AFEX og fortyndet syrebehandlet majsstover viste, at fortyndet syre forbehandling producerer 316% flere syrer, 142% flere aromater, og 3.555% mere furan aldehyder end AFEX36, som alle kan være hæmmende for mikroorganismer35,37. Da AFEX er en tør-til-tør proces, er der heller ikke noget tab af sukker som en fortyndet væskestrøm, der ikke økonomisk kan udnyttes under enzymatisk hydrolyse. Dette fører dog til komplikationer, da enzymer med både cellulosenedbrydende og hemicellulosenedbrydende kapacitet er nødvendige for fuldt ud at nedbryde cellevæggens polysaccharider under enzymatisk hydrolyse til blandet fermenterbart sukker som glukose og xylose. Hemicellulosic oligomerer er blevet rapporteret at hæmme cellulase aktivitet38, hvilket kan nødvendiggøre en højere enzym belastning for at opretholde et højt endeligt sukkerudbytte. Optimering af egnede enzymcocktails kan dog reducere det samlede enzymforbrug under saccharificering af AFEX forbehandlet biomasse39,40,41,42,43,44,45. Under AFEX’s forbehandling fører hydrolyse og ammonolyse af esterforbindelser til dannelse af syre og amidprodukter i den forbehandlede biomasse (f.eks. eddikesyre/ acetamid, ferulicsyre/ferulamid, coumaricsyre/coumarylamid)36. Selv om dannelsen af amider har vist sig at hjælpe gæringsprocessen, kan deres tilstedeværelse ved meget høje koncentrationer i forbehandlede råmaterialer være et problem, hvis fodring af dyr forbehandlede biomer. Forhydrolyse af esterforbindelser med alkali såsom NaOH eller Ca(OH)2 før AFEX forbehandling kan bruges til at løse problemet.
Der er en række sikkerhedsmæssige overvejelser at huske på, når du arbejder med vandfri ammoniak under AFEX-processen. Vandfri ammoniak reagerer med kobber, messing, aluminium, kulstofstål og almindelige fluorelastomerpolymerer, der anvendes i tætninger (f.eks. Enhver slange eller reaktor komponenter, der kan komme i kontakt med ammoniak bør være fremstillet af rustfrit stål, og pakninger, ventil sæder, og hurtig forbindelse sæler bør være fremstillet af Teflon eller Kalrez når det er muligt. Ammoniak betragtes ikke som et giftigt kemikalie, men det er stadig farligt på grund af dets hygroskopiske og kryogene egenskaber. Det let mål og kan alvorligt skade slimhinder i øjnene og åndedrætsorganerne. Ammoniak er en kryogen væske og ammoniak lækager kan forårsage alvorlige forfrysninger på grund af direkte kontakt med gasstrømmen eller kølet udstyr. Ammoniak er umiddelbart farligt for liv og sundhed (IDLH) ved koncentrationer over 300 ppm. Arbejdstagere bør evakuere straks i tilfælde af koncentrationen overstiger 50 ppm. Det anbefales, at operatørerne bærer en kalibreret ammoniakmonitor for at advare om farlige koncentrationer i deres nærhed. Installation af sensorer med alarmer i hovedarbejdsområdet er også tilrådeligt. Arbejdstagere, der håndterer ammoniak, skal være ordentligt uddannet og bære beskyttelsesudstyr såsom udgangsåndedrætsværn udstyret med methylaminpatroner og kryogene og varmebeskyttende handsker og være forberedt på at håndtere nødsituationer. I tilfælde af eksponering for vandfri ammoniak skal operatøren bevæge sig i sikkerhed og straks skylle det berørte område med vand i mindst 15 minutter. Ammoniakforbehandlingsprocessen skal udføres inde i en røghætte, og ammoniakcylinderen skal enten opbevares i en røghætte eller ventileret skab. Efter forsøget vil forbehandlet biomasse have noget restfri ammoniak og skal enten tørres i emhætten natten over eller i en brugerdefineret ventileret tørreboks, før den opbevares i plastikposer ved stuetemperatur til opfølgende eksperimenter. Nogle andre vigtige sikkerhedsovervejelser omfatter installation af et ammoniakfremføringssystem med en flowmåler, der vil bidrage til præcist at levere ammoniak til reaktoren, og en reaktor, der er konstrueret til at håndtere mindst 1,5 gange det tryk, som forbehandlingsprocessen vil blive udsat for (f.eks. til håndtering af AFEX-processen ved 2 x 106 Pa-tryk, skal reaktorens mindste trykklassificering være 3 x 106 Pa).
AFEX forbehandling er en lovende metode til at producere letfordøjelig plantebiomasse, der kan anvendes direkte som dyrefoder eller som råmateriale til fremstilling af brændstoffer og kemikalier. Ud over disse to industrier kan AFEX finde anvendelse på andre områder såsom et biofornyeligt råmateriale til fremstilling af biomaterialer eller som råmateriale til fremstilling af biogas. Laboratorieskalaprocessen kan udføres i et laboratorium, der er udstyret med korrekt ventileret plads og sikkerhedsforanstaltninger, og vores nuværende arbejde bekræfter, at denne nedskalerede AFEX-proces viser lignende resultater som materiale, der genereres i en skaleret og/eller pilot-AFEX-reaktor. AfEX-processen i laboratorieskala kan bruges til at teste råmaterialer, behandlingsbetingelser og applikationer på en højere gennemløbsmåde, samtidig med at der skabes en rimelig forventning om, hvordan processen vil fungere på pilot- eller industrielskala.
The authors have nothing to disclose.
Dette materiale er baseret på arbejde, der delvist støttes af Great Lakes Bioenergy Research Center, U.S. Department of Energy, Office of Science, Office of Biological and Environmental Research under Award Numbers DE-SC0018409 og DE-FC02-07ER64494. Rebecca Ong anerkender delvis støtte fra Michigan Technological University (start finansiering). Shishir Chundawat anerkender delvis støtte fra US National Science Foundation CBET award (1604421), ORAU Ralph E. Powe Award, og Rutgers School of Engineering (Startup Funding). Bruce Dale anerkender delvis støtte fra Michigan State University AgBioResearch kontor og også USDA National Institute of Food and Agriculture. Venkatesh Balan anerkender delvis støtte fra Staten Texas og University of Houston (Startup Funding). MBI medarbejdere anerkender delvis støtte fra det amerikanske Department of Energy og Michigan State University foundation. Endelig vil vi gerne dedikere dette papir til vores mentor og medforfatter Prof. Bruce Dale for at inspirere os til i fællesskab at forfølge vores drøm om at gøre bæredygtige celluloseholdige biobrændstoffer.
Safety Equipment/PPE | |||
Ammonia Monitor | CanarySense | BW GAXT-A-DL | Single gas detector, Ammonia (NH3), 0 to 100 ppm |
Cryogenic gloves | Amazon | B01L8WA238/B01L8WA1H0/B01L8WA1O8 | Keep hands protected when handling liquid ammonia |
Ear muffs | 3M | H7A | Ear muffs to protect hearing when releasing ammonia at end of pretreatment |
Face shield | – | – | Wear while handling ammonia |
Heat protective gloves | Grainger | 2EWX1/2EWX2/2EWX3 | Showa heat resistant gloves, max temperature 500°F |
Nitrile gloves | – | – | Wear while mixing biomass to prevent contamination |
Reagents | |||
Anhydrous Ammonia Compressed Gas Cylinder | – | – | An anhydrous ammonia compressed gas cylinder with a dip tube is required for this process. The dip tube is essential in order to withdraw liquid ammonia from the cylinder. |
Distilled water | – | – | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
Milled or Chopped Corn Stover | – | – | Corn stover is not readily commercially available. Contact local farmers or agricultural extension if you wish to locate some. |
Nitrogen Compressed Gas Cylinder | – | – | |
Equipment | |||
Ammonia Cylinder Adapter | – | – | CGA fitting that depends on the gas cylinder. Matheson is a good source. Some require teflon gaskets. This connects the cylinder to the ammonia delivery system. A regulator is not necessary as the system uses liquid ammonia. |
Ammonia Delivery System (Figure 4) | Swagelok | Misc. | Stainless steel pressure cylinder and components, valves, check valves, and gauges were used for all lines potentially in contact with ammonia. |
Analytical Balance | Sartorius | CPA4202S | Balance used for preparing biomass and weighing the reactors. Toploading balance, 4200g x 0.01g |
Chemraz O-rings | Harvard Apparatus | 5013091 | Ammonia-resistant o-rings for the SS syringe |
Custom Tubular Reactors (Figure 3) | Parts were purchased from McMaster-Carr, Swagelok, Omega, and Motion Industries (Dixon Fittings) | Misc. | To be compatible with ammonia, the custom reactor was constructed from stainless steel components (sanitary tube and fittings, compression fittings, quick connect, pressure gauge, thermocouple), and teflon gaskets. The maximum pressure rating of the vessel is 1500 psig, which is the maximum pressure rating of the bolted sanitary clamps. |
Drying Box | – | – | Optional: an enclosed system for drying is necessary if planning to do microbial experiments to avoid contamination. Avoid drying at elevated temperatures. |
High Pressure Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3311 | Infuse/Withrdraw PHD ULTRA HPSI Programmable Syringe Pump for transferring liquid ammonia |
Moisture Analyzer | Sartorius | MA35 | Moisture analyzer for determining moisture content of biomass prior to pretreatment. |
Nitrogen Delivery | Misc. | Misc. | Nitrogen compressed gas cylinder, inert gas regulator (at least 1000 psig max pressure rating), lines, and valves. |
Ratchet wrench and 7/8" socket | – | – | Ratchet and socket to quickly tighten and open bolts on the sanitary clamp. Can be purchased anywhere. |
Retractable Thermocouple Cables | Omega | RSC-K-3-4-5 | Retractable thermocouple cable. You need one for each reactor. |
Stainless Steel Syringe | Harvard Apparatus | 702261 | Stainless steel syringe for tranferring ammonia to the reactors. |
Temperature Monitor | Omega | HH12B | Dual input temperature monitor. You need one for every two reactors. |
Voltage Controller | McMaster-Carr | 6994K11 | Variable-Voltage Transformer for controlling heating to the reactors. You need one for each reactor. |
Supplies | |||
Metal Scoops, Spoons and/or Spatulas | – | – | For transferring biomass for weighing, mixing, transferring into the reactor and removing from the reactor at the end of the run |
Plastic Bowls or Tubs | – | – | Used for mixing the biomass with the water. Any bowl or tub could be used. |
Spray Bottle | – | – | Used to add water to the biomass to achieve the desired water loading |
Wide-Mouth Funnel | – | – | Any funnel that has a bottom opening 0.5-1.0 inches diameter. |
Wooden Dowel | – | – | 1-1.5" diameter wooden dowel to assist with loading/unloading the reactor |
Consumables | |||
Glass Wool | Sigma-Aldrich | CLS3950-454G | For packing the top of the reactor to prevent biomass escape and clogging the tubing |
Plastic Press-to-Close Bags | McMaster-Carr | 1959T24 | Bags for storing processed samples and for transferring to drying box |
Plastic Tote | – | – | Used to transfer pretreated biomass to an alternate location for drying |
Plastic Weighboats or Metal Trays | – | – | Used to catch the biomass when removing from the reactors, and for storing the samples while drying |