球体、菌落形成测定和斑马鱼移植对抗癌香豆素 OT48 生物活性的临床前评价
Summary
在这里, 我们提出了应用3D 培养和斑马鱼的抗癌香豆素的临床前筛选。
Abstract
在体外和体内对新型治疗药物的临床前筛选是肿瘤药物发现的重要工具。尽管人类癌细胞系对 2D (维) 单层细胞培养中的治疗化合物有反应, 但为了了解药物在生理相关模型中的功效, 开发了3D 培养系统。近年来, 在临床前研究中观察到一个范式的转变, 以验证新分子在3D 培养系统中的效力, 更精确地模仿肿瘤微环境。这些系统以生理上相关的方式描述疾病状态, 有助于获得更好的机械洞察力和对特定分子药理效力的理解。此外, 随着目前在体内肿瘤模型改良方面的发展趋势, 斑马鱼已经成为一种重要的脊椎动物模型, 用来评估体内瘤的形成, 并研究治疗药物的作用。在这里, 我们研究了 hydroxycoumarin OT48 单独或联合 BH3 mimetics 在肺癌细胞系 A549 使用三种不同的3D 培养系统, 包括菌落形成检测 (CFA), 球形形成试验 (林业) 和在体内的斑马鱼移植。
Introduction
癌症是由细胞突变引起的, 因此生化信号通路被打乱, 触发不受控制的细胞分裂和抵抗细胞死亡。肿瘤会影响消化、神经、循环系统和随后邻近组织的生理功能1。尽管广泛的研究工作, 癌症仍然是最普遍的威胁生命的疾病在世界2。精密医学已被公认为未来癌症治疗的基础。新的分子实体与现有药物进行例行测试, 以改善临床结果。
然而, 与开发新的有效靶向疗法相关的一个重要的限制是, 通常使用的化验方法未能模拟药物暴露的确切生物学结果3。癌症药物发现仍然主要依赖于检测在2D 单层培养的癌细胞系中的治疗药物的功效, 这在临床试验中难以证实4。因此, 发展更好的癌症模型, 更好地模仿在体内5的肿瘤的本土特征, 是一个越来越大的兴趣。近年来, 对3D 培养模型的兴趣越来越大, 导致了改进的方法, 以生成3D 肿瘤模型5。
在这里, 我们提出了一个方法与三种不同的3D 细胞培养技术, 允许提高对 hydroxycoumarin OT486的效力的理解, 结合 BH3 mimetics 更深入的体内测定。我们的方法包括结合菌落和 SFAs 与一个在体内的肿瘤形成试验, 基于斑马鱼模型, 以进一步验证 OT48 和 BH3 mimetics 联合在肺癌细胞和监测癌症进展在生活中的效果生物。
菌落形成测定通常用于评估抗癌药物对固体和造血肿瘤的疗效。该化验确定细胞无限增殖的能力, 形成殖民地7。抗癌剂对细胞菌落形成能力的影响由菌落数量和/或大小的减少决定。
球体代表体外肿瘤模型, 作为一种低成本的抗癌药物筛选平台。球体是悬浮或嵌入在3D 基质中的细胞聚集物。该方法广泛应用于药物筛选和肿瘤生长、增殖和免疫相互作用的研究8。
为了充分了解新药的特性, 对啮齿动物进行体内实验是非常必要的。然而, 这种传统的方法是昂贵和费时。近年来, 斑马鱼 (斑马斑马) 成为了一个广泛研究的实验室有机体, 更便宜, 更快地提高。在斑马鱼开发的肿瘤代表了3D 细胞培养方法, 但在体内设置的脊椎动物9。
总之, 我们在这里使用三种不同的3D 文化方法, 包括 CFAs, SFAs 和斑马鱼在体内肿瘤形成, 以证明 hydroxycoumarin OT48 的抗癌能力的肺癌 A549 细胞模型结合 BH3 mimetics。
Protocol
Representative Results
Discussion
MCBM 获得的菌落形成率取决于细胞类型。通常, 对于非黏附细胞来说, 与黏附细胞相比, 菌落数量要高得多。我们观察到, A549 细胞在10天后形成了30到40个菌落。以前我们已经报告了不同的白血病细胞, 殖民地的数量在200到 2509之间。我们的研究结果表明, 单独的 OT48 并没有显著减少菌落数量。然而, 结合 BH3 模拟 A1210477 A549 细胞的菌落形成能力协同降低。此前我们报道, 另一种 hydroxyco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
首尔大学的研究由韩国 MEST 的国家研究基金会 (NRF) 支持, 用于肿瘤微环境全球核心研究中心 (GCRC) 赠款, [赠款编号 2011-0030001];由汉城国立大学研究补助金和由脑韩国 (BK21) 加节目。
Materials
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
