Enkel och effektiv Administration och visualisering av mikropartiklar i cirkulationssystemet av små fiskar använder njure injektion
Summary
Denna artikel visar principerna för en snabb, minimalinvasiv injektion av fluorescerande mikropartiklar i circulatory system av små fiskar och i vivo visualisering av mikropartiklar i fisk blod.
Abstract
Micro-storlek partiklar systemisk administration in i en levande organism kan tillämpas för vaskulatur visualisering, läkemedel och vaccin leverans, implantation av transgena celler och små optiska sensorer. Dock intravenös microinjections i små djur, som oftast används i biologiska och veterinära laboratorier, är mycket svårt och kräver utbildad personal. Vi visar häri, en robust och effektiv metod för införandet av mikropartiklar i cirkulationssystemet av vuxen zebrafiskar (Danio rerio) genom injektion i fisk njure. För att visualisera den introducerade mikropartiklar i kärlsystemet, föreslår vi en enkel intravital bildteknik i fiskarnas gälar. In vivo övervakning av zebrafisk blod pH var fulländad med en injicerade mikrokapslat fluorescerande sond, SNARF-1, att visa en av de möjliga tillämpningarna av den beskrivna tekniken. Denna artikel ger en detaljerad beskrivning av inkapsling av pH-känsliga färgämne och visar principerna för snabb injektion och visualisering av erhållna mikrokapslarna för in vivo inspelning av fluorescerande signalen. Den föreslagna metoden för injektion kännetecknas av en låg dödlighet (0-20%) och hög verkningsgrad (70-90% framgång), och det är lätt att institutet använder allmänt tillgänglig utrustning. Alla beskrivna förfaranden kan utföras på andra små fiskarter såsom guppy och medaka.
Introduction
Förvaltning av mikro-storlek partiklar till en djur organism är en viktig uppgift i sådana områden som läkemedel och vaccin leverans1, vaskulatur visualisering2, transgena cell implantation3och liten optisk sensor implantation 4 , 5. implantation förfarandet för hur provtagningsutrustningen skall partiklar i det vaskulära systemet av små försöksdjur är dock svårt, särskilt för känsliga vattenorganismer. För populära forskning exemplar som zebrafisk, det rekommenderas att dessa förfaranden förtydligas med hjälp av video protokoll.
Intrakardiellt och kapillär microinjections kräver utbildad personal och unik microsurgery faciliteter för leverans av microobjects till zebrafiskar blod. Tidigare har föreslogs en retro-orbital manuell injektion3 som en enkel och effektiv metod för administrering av hela celler. Vår erfarenhet tar på grund av den lilla området av ögat välutbyggt nät, det dock mycket praktik att uppnå det önskade resultatet från denna teknik.
Häri, beskriver vi en metod för robusta och effektiva microparticle implantation in i blodomloppet genom manuell injektion direkt in i njure vävnad av vuxen zebrafiskar, som är rik på kapillärer och nedsatt fartyg. Denna teknik är baserad på video protokollet för stamcellstransplantation till zebrafiskar njure6, men de traumatiska och tidskrävande mikrokirurgisk stegen avlägsnades. Den föreslagna metoden kännetecknas av låg mortalitet (0-20%) och hög verkningsgrad (70-90% framgång), och det är lätt att institutet använder allmänt tillgänglig utrustning.
En viktig del av föreslagna protokollet är visualisering av den implanterade mikropartiklar (om de är fluorescerande eller färglagt) i gill kapillärerna, som möjliggör kontroll av injektion kvaliteten, en grov relativ bedömning av antalet injicerade partiklar, och upptäckt av spektral signalen för fysiologiska mätningar direkt från cirkulerande blod. Som ett exempel på de möjliga tillämpningarna av den beskrivna tekniken, vi visar protokollet för i vivo mätningar av zebrafisk blod pH med ett Mikroinkapslat fluorescerande sond, SNARF-1, ursprungligen föreslagits i Borvinskaya et al. 20175.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att demonstrera injektionen av mikropartiklar i zebrafiskar njuren, använde vi ljusgenomsläppande mikrokapslar laddad med en indikator färgämne. Således, protokollet innehåller instruktioner för tillverkning av mikrokapslarna använder lager-för-lager assembly motsatt laddade polyelektrolyter7,8,15,16,17 ,18 (<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner kraftigt hjälp av Bogdan Osadchiy och Evgenii Protasov (Irkutsk State University, Ryssland) i förberedelse av protokollet video. Denna forskning stöddes av den ryska Science Foundation (nr 15-14-10008) och ryska Foundation för grundforskning (nr 15-29-01003).
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, &. #. 1. 0. 4. 5. ;., Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. . ImageJ User Guide – Version 1.44. , (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
