Aqui nós apresentamos protocolos para coletando e microinjecting precellular milho ocidental embriões repele com a finalidade de realizar ensaios funcionais-genômica como germline transformação e edição de CRISPR/Cas9-genoma.
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Artigo de método
Microinjeção de Western milho repele, Diabrotica virgifera virgifera, embriões de transformação da linha germinal, ou edição de genoma CRISPR/Cas9
Neste artigo
Resumo
Resumo
Repele o milho (RPT) é uma importante praga do milho e é conhecida por sua capacidade de rapidamente se adaptar às estratégias de manejo de pragas. Embora o RNA de interferência (RNAi) provou para ser uma poderosa ferramenta para estudar Biologia WCR, tem suas limitações. Especificamente, RNAi em si é transitório (ou seja, não resulta em longo prazo mendeliana do fenótipo associado), e exige saber a sequência de DNA do gene alvo. Este último pode ser um fator limitante se o fenótipo de interesse é controlado por genes mal conservados, ou mesmo romance, porque identificar alvos úteis ia ser um desafio, se não impossível. Portanto, o número de ferramentas caixa de ferramentas genômicas do WCR deve ser expandido pelo desenvolvimento de métodos que pode ser usada para criar cepas mutantes estáveis e permitir pesquisas independentes de sequência do genoma WCR. Neste documento, detalhamos os métodos usados para coletar e microinjeção precellular WCR os embriões com ácidos nucleicos. Enquanto os protocolos descritos visam a criação de transgénico WCR, edição de CRISPR/Cas9-genoma poderia também ser realizada utilizando os mesmos protocolos, com a única diferença é a composição da solução injetada os embriões.
Introdução
Repele do milho ocidental (RPT), Diabrotica virgifera virgifera, é uma praga importante do milho1. Curiosamente, WCR aparece superar o controle mede mais rapidamente do que as pragas mais agrícolas, desde que eles não só se adaptar fisiologicamente mas também comportamentalmente2,3,4,5, 6. na última década, o RNA de interferência (RNAi), uma poderosa ferramenta de genômica funcional, foi investigado como um método de controle potencial para WCR7....
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Protocolo
1. nível de colônia de criação dos adultos WCR
- Obter uma quantidade suficiente de adultos WCR (500-1.000) de um laboratório confiável de empresa ou de pesquisa (ver Tabela de materiais para obter um exemplo) e coloque em uma gaiola de3 30 cm.
Nota: O uso de uma cepa não-diapausing é altamente recomendado. - Preparar a dieta artificial WCR, seguindo o protocolo do fabricante e despeje uma camada de 1 cm de espessura em um recipiente de 38 oz (ver Tabela de materiais). Após a mistura, armazene dieta não utilizada a 4 ° C por até 2 meses.
- Colocar uma placa de Petri (100 x 15 mm) com dieta adulta ....
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Resultados
Uma consideração importante ao desenvolver este protocolo foi palco do desenvolvimento embrionário no momento da microinjeção. Especificamente, o germline transformação requer microinjeção de DNAs antes celularização embrionária. Isso ocorre porque o DNAs facilmente não podem atravessar as membranas celulares. Tenta visualizar os estágios do desenvolvimento embrionário WCR, usando uma mancha nuclear não tiveram sucesso porque dechorionation de embriões WCR essencialmente dissolve todas as.......
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Discussão
Embora microinjection de WCR com dsRNAs com a finalidade de RNAi tem sido relatado9, este é o primeiro protocolo para estabelecer as melhores práticas para microinjecting precellular embriões WCR, um processo crítico para a realização da linha germinal transformação e/ou CRISPR/Cas9 genoma edição nesta espécie. Sucesso microinjeção de embriões WCR é dependente de muitos fatores, como eficiência de transformação. Discutidas a seguir estão algumas das principais questões impactando o resultado do us.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do programa de pesquisa Monsanto milho Rootworm conhecimento, conceder número AG/1005 (ao MDL e YC) e fundos de start-up de MDL da NCSU. FC foi apoiado por subsídios do programa de pesquisa de conhecimento para repele de milho da Monsanto (AG/1005) e o National Science Foundation, conceda número MCB-1244772 (MDL). Os autores declaram não interesses concorrentes. FC e MDL concebido e desenhado os experimentos; FC, PW e SP realizaram os experimentos; FC e MDL analisaram os resultados; e FC, NG e MDL escreveram o manuscrito. Agradecemos a Teresa O'Leary, William Klobasa e Stephanie Gorski por sua assistência especializada em triage....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Papel de Filtro Qualitativo (Preto) | Ahlstrom | 8613-0900 | Para microinjeção de ovo |
| Recipientes de 1 oz | Talheres de Plástico Anny's | ASET101 | Recipiente para ovos |
| Drosophila Agar Tipo II | Apex | 66-103 | Substrato para prato de postura de ovos WCR |
| Fórceps Featherweight | Bioquip | 4748 | Manuseio de larvas e pupas |
| Clorox Regular-Bleach1 | Clorox | 44600-30770 | Lave milho e pratos |
| Trucker's Favorite Yellow | Coor Farm Supply | 502 | Milho para alimentação Sistema |
| Microinjeção WCR (Caseiro) | NA | Peças e instruções disponíveis mediante solicitação | Controla a pressão de injeção (0-20 psi) |
| Elmer's Non-toxic Glue | Elmer's Products, Inc. | E304 | Cole ovos em papel de filtro |
| epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Pontas de carregamento de agulhas de aterro |
| Falcon Tissue Culture Plates | Falcon | 25383-103 | Milho germinado /150 x 25 mm |
| Fisherbrand Círculos de Papel de Filtro de Grau Quantitativo | Fisher Scientific | S47576C | Prato de Fazer ágar para postura de ovos/9cm |
| Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Lavar pratos |
| Lâminas de Microscópio Simples | Fisher Scientific | 12-549-3 | Segurando papel de filtro e ovos para microinjeção |
| Verme da Raiz do Milho Ocidental sem Substituto de Pólen | Frontier Agricultural Sciences | F9766B | WCR Bolas de Algodão para Dieta Artificial para Adultos |
| , Grandes | Genesee Scientific | 51-101 | Feche o frasco |
| Pipetas de Transferência de Bulbo Pequeno Globe Scientific 3.0 mL | Globe Scientific | 137035 | Colete e transfira ovos |
| Estereomicroscópio de Fluorescência Leica M165 FC | Leica | M165 FC | Triagem WCR |
| Conjunto de Filtros DsRed para Estereomicroscópio de Fluorescência | Leica | DSR | Filtro de excitação: 510-560 nm, filtro de emissão: 590-650 nm |
| Filtro EGFP | Leica | GFP2 | Filtro de excitação: 440– 520 nm, filtro de emissão: 510 nm |
| BugDorm | MegaView Science | DP1000_5P | Cage para colônia adulta |
| Pincel de pintura miniatura | MyArtscape | MAS-102-MINI | Liner 2/0 |
| Micromanipulador de Joystick | Narishige | MN-151 | Micromanipulador e porta-agulha |
| Microscópio XY Stage | Olympus | 265515 | Microscópio stage (adaptado para uso com estereoscópio) |
| Gaze de Grau 90 | Loja Online de Tecidos | CHEE90 | Para Egg-Lay |
| Filme de parafina de plástico | Embalagem Plástica Pechiney | PM-996 | Selar prato de ágar após microinjeção/Tamanho do rolo 4 in. x 125 pés |
| Incubadora | Percival | de Crescimento WCR I41VLH3C8 (incubadora de criação de insetos) | |
| Frascos Erlenmeyer de Boca Estreita | VWR | 4980-300-PK | Recipiente de água para colônia adulta |
| Copos de Forma Baixa Griffin | VWR | 1000-600-PK | Para Lavagem |
| Ovos Rolos de Algodão Trançado | Richmond Dental Cotton Co. | 605-3599 | Uso no abastecimento de água para colônias de adultos |
| Placas de Petri (35x10mm) | SIGMA | CLS430588-500EA | Para placas de dieta |
| Fenol Vermelho | Sigma | 143-78-8 | Tampão de microinjeção |
| Extrator de micropipeta baseado em laser | Instrumento Sutter | P-2000/G | Extrator de agulhas/Calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100 |
| Solo superficial premium | The Scotts Company | 71130758 | Solo para cultivo |
| de cronSacos com zíper Reloc Zippit 2 Mil | United States Plastic Corporation | 48342 | Saco de ágar após microinjeção/5x7 |
| Placas de Petri (100x15m) | VWR | 89038-968 | Fazendo prato de ágar para postura de ovos/ Recipientes de 100 x 15 mm |
| 6 oz | Webstaurantstore | 128E506 | WCR câmara de acoplamento de par único |
| Recipientes de 38 oz | Webstaurantstore | 128NC888 | Caixa de criação de larvas/38 oz |
| ChoiceHD 16 oz. Recipiente de plástico translúcido para micro-ondas | Webstaurantstore | 128HRD16 | Caixa de criação de larvas/16 oz |
| Escopo de microinjeção | Wild Heerbrugg | WILD-M8 | Escopo de microinjeção equipado com um estágio XY |
| Capilares de vidro padrão | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Agulhas de microinjeção |
| Vermes da raiz do milho ocidental | adulto North Centeral Pesquisa aquícola Laboratório | Cepa não diapase | Solicitação do laboratório do Dr. Bryan Wade French |
| Kit Midi de DNA de plasmídeo | Qiagen | 12143 | Purificação de DNAs de plasmídeo prontos para injeção |
Referências
- Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest. Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).
- Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W.
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Reimpressões e permissões
