분열 효 모 섬으로 불안정 프로테아좀 돌연변이 선택할 임의의 Mutagenesis 유전자 타겟팅
Summary
이 문서에는 분열 효 모에 대상 유전자의 무작위 mutagenesis에 대 한 자세한 방법을 설명합니다. 예를 들어, 우리가 대상 rpt4 +, 19S 프로테아좀 섬으로 불안정 돌연변이 대 한 스크린의 소 단위를 인코딩하는.
Abstract
대상 유전자의 무작위 mutagenesis 원하는 표현 형을 생성 하는 돌연변이 식별 하기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 무작위 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다 방법의 오류가 PCR는 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 편리 하 고 효율적인 전략 이다 (즉., 돌연변이 도서관). 연구원은 다른 게놈 영역을 영향을 받지 떠나는 동안 유전자의 코딩 지구 같은 미리 정의 된 영역을 변형 하고자 하는 경우 오류가 PCR 방법의 선택입니다. 돌연변이 라이브러리 오류가 PCR에 의해 증폭 되어, 후 적당 한 플라스 미드로 복제 해야 합니다. 오류가 PCR에 의해 생성 된 라이브러리의 크기는 복제 단계의 효율에 의해 제한 됩니다. 그러나, 분열 효 모, Schizosaccharomyces pombe, 복제 단계는 매우 효율적인 원스텝 퓨전 변환에 대 한 구문을 생성 하는 PCR의 사용으로 대체할 수 있습니다. 원하는 고기의 돌연변이 다음 적절 한 기자를 사용 하 여 선택할 수 있습니다. 여기,이 전략 자세하게, 예를 들어, centromeric 섬으로에 삽입 기자 복용 설명 합니다.
Introduction
앞으로 유전학 연구원 추구 특정 표현 형을 표시 하는 자연적 사건 돌연변이 및 유전 분석을 수행 고전적인 방법입니다. 반전 유전학에서 관심사의 유전자에 돌연변이 소개 하 고 표현 형 검사. 후자의 경우 대상 유전자의 무작위 mutagenesis 이후에 온도 감도 등 원하는 고기에 대 한 선택 또는 효소 활동을 변경 하는 돌연변이의 풀을 생성 하 자주 사용 됩니다. 다양 한 방법은 오류가 PCR1;를 포함 하 여 임의의 mutagenesis 달성 하는 데 사용할 수 있습니다. UV 방사선 조사2. 화학 mutagens, 에틸 methanesulfonate (EMS) 등 질소 산3; – mutD5 4; 표현 등 임시 mutator 긴장의 사용 그리고 DNA5를 걸어 갔다입니다.
여기, 우리는 우리 분열 효 모에 대상 유전자 돌연변이 풀을 생성 하는 오류가 PCR을 이용 하는 반전 유전학 전략을 설명 합니다. 로 한의 이름에서이 메서드는 PCR 동안 일부러 오류를 도입 하 여 돌연변이 생성 합니다. 다른 mutagenesis 방법과 달리 오류가 PCR mutagenized 될 영역을 정의 하는 사용자 수 있습니다. 이것은 관심사의 단백질/도메인의 기능을 연구 하는 노력에 특히 유용 하다.
이 무작위 mutagenesis 절차를 보여, 우리 여기 사용 rpt4 +, 19S 프로테아좀 소 단위를 인코딩하는 예를 들어. Rpt4 분열 효 모6,7,,89, 다른 유기 체에 있는 베이스-독립적인 기능을가지고 표시 되었습니다 및 베이스 결함 단백질을 변경 하 여 간접 효과 일으킬 수 있습니다. 수준입니다. 우리는, 그러므로, 섬으로에 프로테아좀의 기능을 조사 하는 목적으로 베이스-독립적인 변화를 유발 하는 돌연변이 대 한 검사.
오류가 PCR 뇌관을 바인딩할 위치를 조정 하 여 어떤 유전자 영역에 적용할 수 있습니다. 적절 한 기자와 원하는 phenotypic 변화 하는 돌연변이 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 ade6 + 기자 삽입 활용는 centromere 1 외부 반복 (otr) 지역10. Ade6 + 기자 야생-타입 상태;에서 침묵은 그래서 제정 섬으로이 지역11에 형성 된다 이 빨간 식민지10으로 표시 됩니다. Centromere는에 제정 섬으로 destabilizes 하는 돌연변이 ade6 + 기자, 백색 식민지로 시각 이다는 식으로 이어질 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
오류가 PCR 통해 임의의 mutagenesis 주어진된 지역에서 돌연변이의 다양 한 풀을 생성 하기 위한 강력한 도구입니다. 이 기술은 특정 상황에서 단백질의 기능을 평가 하는 연구에 대 한 특히 유용 합니다. 예, 우리는 여기는 19S 프로테아좀 소 단위, Rpt4, 섬으로 유지 보수에서의 기능을 평가 하기 위해 오류가 PCR을 사용. 변화 하 여 지역 오류가 PCR에 의해 표적으로 하 고 심사 조건 조정, 우리 관심 및 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트에 대 한 지원 자금 기본 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 과학과 ICT (2016R1A2B2006354)에 의해 자금에 의해 제공 되었다.
Materials
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
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