JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

基因靶向随机诱变在裂变酵母中选择染色质稳定蛋白酶突变体

Published: May 15, 2018
doi:
10.3791/57499
,
1Department of Biological Sciences,Korea Advanced Institute of Science and Technology

Summary

本文介绍了一种用于裂变酵母靶基因随机诱变的详细方法。例如, 我们针对的是rpt4+, 它对19S 蛋白酶体的亚基进行编码, 并筛选出破坏染色质的突变。

Abstract

随机突变的目标基因通常是用来确定突变, 产生预期的表型。在可用于实现随机诱变的方法中, 容易出错的 PCR 技术是一种方便而有效的策略, 用于生成多样性的突变体 (i. e, 一个变种人库)。容易出错的 PCR 是一种选择的方法, 当研究人员试图变异一个预先定义的区域, 如编码区域的基因, 而离开其他基因组区域不受影响。突变体库通过易出错的 PCR 扩增后, 必须克隆成合适的质粒。由于克隆步骤的效率的限制, 容易出错的 PCR 所产生的库的大小受到制约。然而, 在裂变酵母中,粟粟中, 克隆步骤可以用高效的一步融合 PCR 来代替, 从而产生转化的构造。然后, 可以使用适当的记者选择所需表型的突变体。在这里, 我们详细描述了这个策略, 以一个例子, 一个记者插入到 centromeric 染色质。

Introduction

前遗传学是一种经典的方法, 研究人员寻找自然发生的突变体, 显示特定的表型, 并进行遗传分析。在反向遗传学中, 突变被引入到一个感兴趣的基因中, 并检查表型。在后一种情况下, 目标基因的随机突变经常被用来产生一个突变体, 随后被选择为期望的表型, 如温度敏感性或改变的酶活性。各种方法可用于实现随机突变, 包括易出错的 PCR1;紫外线照射2;化学诱变, 如甲基磺酸乙酯 (EMS) 或一氧化二氮3;使用临时突变菌株, 如过度表达mutD5 4;和 DNA 洗牌5。

在这里, 我们描述了一个反向遗传学策略, 我们利用易出错的 PCR 产生突变池的目标基因的裂变酵母。从它的名字可以推测, 这种方法通过在 PCR 过程中故意引入错误来产生突变。与其他突变方法不同, 容易出错的 PCR 允许用户定义要 mutagenized 的区域。这使得它特别有用的努力研究的功能蛋白质/领域的兴趣。

为了演示这个随机的突变过程, 我们在这里使用rpt4+, 它编码19S 蛋白酶体亚基, 作为一个例子。Rpt4 在裂变酵母6、7、8、9之外的有机体中已被证明具有与蛋白质分解无关的功能, 而蛋白质水解的缺陷可能通过改变蛋白而导致间接影响。水平。因此, 我们对突变体进行了筛选, 从而引发了与蛋白水解无关的变化, 目的是研究蛋白酶体对染色质的作用。

通过调整引物的位置, 可将易出错的 PCR 应用于任何基因区域。表现出期望表型变化的突变体可以与适当的记者鉴别。在这里, 我们使用了插入到着丝粒1外部重复 (工程机械)区域10的ade6+ 记者。本构染色质是在该区域11上形成的, 因此在野外类型条件下, ade6+报告器处于静音状态;红色殖民地10表示这一点。在着丝粒上破坏本构染色质的突变将导致ade6+ 的表达式, 该报告被可视为白色的菌落。

Protocol

1. 媒体的准备工作 用补充剂 (是的), 没有腺嘌呤 (是低艾德), 粟谷氨酸培养基 (普纳12) 和普纳, 没有腺嘌呤 (普纳), 通过混合组件, 如表 1中所述, 准备酵母提取物。是-艾德 (低艾德) 和普纳板有所有相同的成分, 但腺嘌呤是从后者省略。 使用以下盐 (50x) 库存: 52.5 克/升氯化镁2· 6H2O, 2 克/升 CaCl2· 2H2O, 50 克/升氯化钾, 2 克/升…

Representative Results

通过遵循图 1中描述的过程, 可以通过评估菌落的颜色来分析获得的 Rpt4 突变体。在减少图 2中的单元格数时, 会在相关的板块上发现菌落的颜色。插入到染色质区域的ade6+报告器在野生类型中被静音, 并显示在 “YES” 板块中的红色菌落。一旦染色质被破坏, 并且ade6+报告器被表达, 可以在 “YES” 板块中观察到白色的菌落, …

Discussion

随机突变通过容易出错的 PCR 是一个强大的工具, 以产生一个不同的突变池在某一地区。这种技术对于那些试图在特定情况下评估蛋白质功能的研究尤其有用。例如, 我们在这里使用了易出错的 PCR 评估19S 蛋白酶体亚基, Rpt4, 在染色质维护的功能。通过改变容易出错的 PCR 和调整筛选条件的区域, 我们能够在感兴趣的基因组区域和屏幕上变异细胞, 以期望的表型。最近, 一种类似的方法被用来隔离在主…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

该项目的资金支助由科学和信息和通信技术部 (2016R1A2B2006354) 资助的韩国国家研究基金会 (NRF) 提供。

Materials

1. Media
Glucose Sigma-Aldrich G8270-10KG
Yeast extract BD Biosciences 212720
L-Leucine JUNSEI 87070-0310
Adenine sulfate ACR 16363-0250
Uracil  Sigma-Aldrich U0750
L-Histidine Sigma-Aldrich H8125
KH2PO4 Sigma-Aldrich 1.05108.0050
NaCl JUNSEI 19015-0350
MgSO4•7H2O Sigma-Aldrich 63140
CaCl2 Sigma-Aldrich 12095
Potassium phthalate Sigma-Aldrich P6758-500g
Inositol Sigma-Aldrich I7508-50G
Biotin Sigma-Aldrich B4501-100MG
Boric Acid Sigma-Aldrich B6768-1KG
MnSO4 Sigma-Aldrich M7634-500G
ZnSO4•7H2O  JUNSEI 83060-031
FeCl2•4H2O KANTO CB8943686
Sodium molybdate dihydrate YAKURI 31621
KI JUNSEI 80090-0301
CuSO4•5H2O YAKURI 09605
D-myo-inositol MP biomedicals 102052
Pantothenate YAKURI 26003
Nicotinic Acid Sigma-Aldrich N4126-500G
(NH4)2SO4  Sigma-Aldrich A4418-100G
Agarose Biobasic D0012
G418, geneticin LPS G41805
2. Enzyme reactions
PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase Aglient 600380 For site-directed mutagenesis
GeneMorphII Random mutagenesis Kit Aglient 200500 For error-prone PCR
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher F-530L For fusion PCR
Ex Taq DNA Polymerase Takara RR001b For general PCR
BamH1 New England BioLabs R0136S
Xho1 New England BioLabs R0146S
Dpn1 New England BioLabs R0176S
3. Equipment
Velveteen square, black VWR 89033-116 For replica
Replica-plating tool VWR 25395-380 For replica
MicroPulser Electroporator Biorad 1652100  For fission yeast transformation
Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap Biorad 1652086  For fission yeast transformation
Thermal Cycler Bioer BYQ6078 For fusion PCR ramp reaction 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
  2. Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
  3. Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
  4. Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
  5. Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
  6. Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
  7. Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
  8. Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
  9. Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
  10. Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
  11. Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
  12. Forsburg, S. L. . Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , (2011).
  13. . . QIAquick PCR Purification Kit. , (2013).
  14. . . pBlueScript II Vector. , (2005).
  15. . . QIAquick Gel Extraction Kit. , (2013).
  16. . . QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , (2016).
  17. . . PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , (2004).
  18. . . Gibson Assembly Master Mix. , (2017).
  19. . . GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , (2012).
  20. . . Plasmid Plus Midi Kit. , (1999).
  21. Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
  22. Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
  23. Nurse, P. . Fission Yeast Handbook. , (2000).
  24. Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
  25. Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
  26. Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
  27. Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).

Tags

Gene-targeted Random MutagenesisHeterochromatin-destabilizingProteasome MutantsFission YeastError-prone PCRTransformation-fusion ConstructElectroporationSorbitol WashHeterochromatin Formation And Maintenance
check_url/57499?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Seo, H. D., Lee, D. Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast. J. Vis. Exp. (135), e57499, doi:10.3791/57499 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image