Her presenterer vi en protokoll for å generere en 3D organotypic melanom spheroid huden modell som viser både arkitekturen og flercellet kompleksiteten av et orgel/svulst i vivo , men samtidig plass systematisk eksperimentell intervensjon.
Malign transformasjon av melanocytter, pigment cellene i huden, forårsaker dannelsen av melanom, en svært aggressiv kreft med økt metastatisk potensial. Nylig, mono-chemotherapies fortsette å forbedre av melanom spesifikke kombinasjonen terapi med målrettede kinase hemmere. Metastatisk melanom gjenstår fortsatt, en livstruende sykdom fordi svulster utstillingen primær resistens eller utvikler resistens mot romanen terapi, og dermed gjenvinne tumorigenic kapasitet. For å bedre den terapeutiske suksessen til malignt melanom, er bestemmelse av molekylære mekanismer overdragelse motstand mot konvensjonelle behandlingsmetoder nødvendig; Imidlertid krever det nyskapende mobilnettet i vitro modeller. Her introduserer vi en i vitro tredimensjonale (3D) organotypic melanom spheroid modell som kan skildre arkitektur i vivo svulst og kan garanterer ny innsikt i intra-tumoral og svulst vert interaksjoner. Modellen har definert antall eldre og differensiert melanom spheroids i en 3D menneskehud full rekonstruksjon modell som består av primære hudceller. Innebygde melanom spheroids mobilnettet sammensetning og differensiering status er lik en av kutan melanom metastasering i vivo. Med denne organotypic melanom spheroid modellen som en narkotikarelaterte screening plattformen støtter identifikasjon av reagerer på valgt kombinasjon terapier, skåner unødvendige behandling byrden for ikke-respondere, og dermed øke fordelen av terapeutisk intervensjon.
Den menneskelige huden består av to forskjellige avdelinger som serverer ulike funksjoner i å beskytte kroppen fra miljømessige bivirkninger1. Lavere dermal rommet består av en fibro-elastisk bindevev. Det består av løst koblet kollagen og elastin fibre syntetisert av fibroblaster, tjene en mekanisk barriere-funksjon. Dermis er separert fra øvre overhuden den basale lamina som er produsert som en ekstracellulær matrix på grunn av konstant kommunikasjon mellom begge hud avdelinger. I motsetning til dermis, overhuden er en plateepitel epitel som hovedsakelig består av keratinocytter og kan differensieres til fire lag. Stratum basale består av udifferensierte basale keratinocytter som stadig avledet fra huden progenitor celler stratifying gjennom stadier av stratum spinosum og stratum granulosum inn i stratum corneum å beskytte kroppen fra dehydrering og infeksjoner2. Melanocyttene er justert på basale membranen og kommunisere gjennom dendrittiske extensions med flere keratinocytter. De produserer pigmentet melanin å beskytte huden vev fra de negative effektene av UV-stråling, som aldring av huden, immunsuppresjon, betennelse og induksjon av ikke-melanom hudkreft. UV stråler bidrag til transformasjonen av melanocyttene til malignt melanom, men er fortsatt under debatten3.
Melanom utvikling er differensiert i forskjellige svulst progresjon stadier, og preget av visse genetisk morfologiske og histologic endringer4. De kommer enten de novo eller fra en medfødt eller ervervet nevus på grunn av en lokal øke melanocyte spredning forårsaker godartet neoplasi. Denne forløper lesjon kan konvertere til strukturelt endret dysplastic vev som inneholder atypic celler, som kan fortsette til første ondartet scenen, det radielle vekstfase (RGP). Denne tidlige svulst progresjon fasen er preget av celler radielt voksende i epidermis, viser noen lokalt invasiv celler innenfor papillary dermis. Under påfølgende vertikale veksten fase (VGP) melanom viser celler allerede en metastatisk og invasive fenotypen ved å bryte gjennom den basale lamina å infiltrere dypere deler av dermis samt subkutant vev5. Til slutt, i metastatisk melanom (MM) representerer mest aggressive progresjon scenen med metastatisk celler systemisk sprer seg i blod og lymfe systemet å invadere distally organer som lever, lunge og hjernen6.
Hittil fortsatt tidlig diagnose etterfulgt av kirurgi den mest effektive terapien til malignt melanom. Prognosen for pasienter med Fjern metastasering, imidlertid spesielt dårlig7, fordi klassisk kjemoterapi regimer tildele bare liten overlevelse fordel8,9. Imidlertid etter tiår med stagnasjon, har nylige fremskritt innen målrettet terapi betydelig bedre prognoser til malignt melanom.
Feilregulering to store mitogen aktivert veier, RAS-RAF-MEK-ERK og PI3K-AKT-PTEN-signalveier, presenterer viktige drivere av melanom progresjon, spesielt når aktivere constitutively punktet mutasjoner av proto-oncogenes BRAFV600 og NRAS er tilstede10. Følgelig lovet oppfinnelsen av målrettede kinase hemmere terapeutiske fordel for metastatisk melanom pasienter. En rekke kliniske studier utført til dette punktet oppnådd ikke betydelig fordel for pasienter med metastatisk melanom. Nesten alle reaksjoner er delvis, med en subpopulasjon av pasienter viser primær resistens. Videre ble oppkjøp av sekundær resistens fører til tilbakefall observert i fleste pasienter11,12.
Det blir klart at analyse av mutasjon statusen alene ikke er tilstrekkelig til å utvikle den mest potente terapeutiske strategien. Nye raske og pålitelige diagnostiske verktøy er nødvendig systematisk registrere og analysere responsen til enkelte kreftceller. Majoriteten av tilgjengelige data på menneskelig melanom er anskaffet fra todimensjonal (2D) melanom cellekulturer. Kreftceller, men dyrket i 3D tillate intercellulære crosstalk mellom differensiert kreft cellen subpopulasjoner også mellom kreftceller og de ikke-transformert omkringliggende vert vev. Derfor det ville være best å rekonstruere 3D-miljøet som melanom utviklet, som en prekliniske screening modell13,14.
Organotypic melanom spheroid huden modellen innført her garanterer ny innsikt for en dypere forståelse av intra-tumoral og svulst vert interaksjon, og gir en avansert screening plattform for å studere molekylære mekanismer av tumor utvikling og terapi motstand i fremtiden.
Å garantere best fysiologiske og i vivo mimicking for huden rekonstruerer, kvaliteten på primære cellene er av største betydning. Som nevnt ovenfor, juvenile eller Pre-Natal hudceller Vis laveste differensiering karakteren og er derfor best egnet til å generere full-tykkelse huden ekvivalenter. Den første mulige kvalitetskontrollen er omfanget av dermal sammentrekning på dag 2 etter såing av keratinocytter og equilibrating gel til EGF (protokollen avsnittene 8.2 og 8,3). Dermal gels krymper de med den beste kvaliteten på fibroblaster. Integrering av for få eller for mange fibroblaster kan også svekke dermal sammentrekning og dermed feste den epidermal dermal rommet. Dette vil i sin tur invadere epidermal differensiering, fordi denne prosessen krever en omfattende kryss-snakk mellom dermal og epidermal celler.
Kvaliteten på primære celler er også kritisk avhengig av cellen confluency samt passering av cellene. Hvis keratinocytter er vokst til ≥80% confluency de umiddelbart stoppe voksende og begynne å skille. Det er derfor viktig å kultur dem til 40-70% confluency i passaging og bruker dem ikke senere enn passering 3-4. Fibroblaster er mindre følsomme, men bør ikke brukes senere enn passasje 4-6. Vær også oppmerksom på at alle primære celler og linjer brukes til å generere organotypic melanom spheroid huden modeller er kultivert uten antibiotika, og derfor forurensning risikoen er høy. Men tillegg av antibiotika endrer fysiologi av de enkelte cellene og dermed reduserer kvaliteten på huden ekvivalenter.
Generelt, er svulst formet formasjon mulig fra nesten alle typer av svulst cellelinjer og også fra kreftceller fersk isolert fra pasienten materiale. Den første celle og/eller dyrking tiden for å få optimal spheroid størrelser kan variere avhengig av hvilken celle brukes. Størrelsen på 150-200 µm, kan alle celler i en spheroid fortsatt tilstrekkelig leveres med næringsstoffer via enkel spredning. Bare spheroids med størrelser ≥500 µm viser en høy grad av differensiering og representerer typiske egenskapene til ikke-Stangeriaceae tumor vev22.
Organotypic melanom-formet-hud-modellen utviklet her er spesielt egnet til å studere svulst vert interaksjoner og melanom-narkotikatesting under i vivo-liker forhold15. Likevel er miljøet av melanom i vivo enda mer komplisert, skjuler en rekke svulst forbundet celletyper, inkludert immunceller og endotelceller. Siden tillegg av riktig primære immunceller står overfor problemer med histocompatibility, er disse modellene ikke ennå kjøpedyktig dataskjerm tilstrekkelig immun-terapeutiske metoder.
Likevel melanom spheroids kan genereres fra ferske isolert pasienten materiale og når inkludert i full hud rekonstruere, kan tjene som individuelle narkotika screening plattformer. Med integrering av melanom metastasering i huden rekonstruerer er tenkelig å teste stoffet kombinasjoner i en tilpasset terapeutisk tilnærming. Inkludert organotypic 3D hud-melanom-modellen i preklinisk testing er sannsynlig å sikre at bare de mest lovende romanen terapeutiske begrepene blir tatt frem i klinisk testing, dermed redusere den utmattelseskrig rate potensielle nye behandlinger for dette sykdom og øker frekvensen av terapeutiske suksess i kliniske forsøk.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Hanna Voersmann for å etablere 3D organotypic melanom-formet-hud-modellen og gir utmerket protokoller. Forfatterne takker også Silke Busch verdifulle kundestøtte. Arbeidet ble støttet av BMBF e: Med programmet “Melanom Sensitivity” 031A423A.
fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |