Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo

Summary

Nous présentons une méthode qui peut donner un aperçu de l’événements précoces qui sous-tendent la neurodégénérescence davantage et basée sur la technique de cerveau établies ex vivo , combinant les avantages des expériences in vivo et in vitro . En outre, il représente une occasion unique pour une comparaison directe du groupe traité et non traité dans le même plan anatomique.

Abstract

Malgré les nombreuses études qui visent à développer des modèles animaux fiables qui soit le principal processus neurodégénérescence sous-jacent, très peu ont été largement acceptées. Ici, nous vous proposons une nouvelle procédure adaptée de la célèbre ex vivo cerveau tranche technique, qui offre une plus étroite en vivo-comme scénario que les préparations in vitro , pour étudier les premiers événements déclenchant la dégénérescence des cellules, comme observés dans la maladie d’Alzheimer (ma). Cette variation se compose des étapes simples et facilement reproductibles, qui permettent la préservation de la cytoarchitecture anatomique de la région du cerveau sélectionné et ses fonctionnalités locales dans un milieu physiologique. On trouvera différentes zones anatomiques du cerveau même, qui donne la possibilité d’effectuer des expériences multiples avec les traitements en question dans un site, dose et fonction du temps. Les limites potentielles qui pourraient affecter les résultats associés à cette méthodologie sont liées à la conservation du tissu, c'est-à-dire le maintien de son intégrité anatomique pendant les opérations de tranchage et d’incubation et de l’épaisseur de coupe, qui peut influencer l’analyse biochimique et immunohistochimiques. Cette approche peut être utilisée à différentes fins, p. ex., examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans des conditions physiologiques ou pathologiques, dépistage des drogues ou des essais de dose-réponse. Enfin, ce protocole pourrait également réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études comportementales. L’application rapportée ici a été récemment décrite et testée pour la première fois sur ex vivo rat tranches de cerveau contenant le prosencéphale basal (BF), qui est l’une des régions cérébrales touchées principalement dans AD. Plus précisément, il a été démontré que l’administration d’un peptide toxique provenant de l’extrémité C-terminale de l’acétylcholinestérase (AChE) pourrait inciter un profil AD, déclenchant, le long de l’axe antéro-postérieur de la BF, une expression différentielle de altérée dans AD, tels que le récepteur nicotinique alpha7 (α7-CNCDH), les protéines phosphorylées Tau (p-Tau) et la protéine bêta-amyloïde (Aß).

Introduction

AD est qu'une pathologie chronique caractérisée par l’atteinte neurodégénérative progressive affectant les zones du cerveau différentes, comme le cortex entorhinal (EC), BF, hippocampe (HC) et bulbe olfactif (OB)^{1,2,3, 4,5}. Les derniers stades de développement AD mener à un déclin cognitif progressif, faisant de cette maladie la forme la plus courante de démence, représentant environ 70 % de tous les cas⁶. Malgré les tentatives étendues pour comprendre les étapes initiales causant d....

Protocol

Toutes les études animales ont été effectuées en vertu de protocoles approuvés.

Remarque : Dans cette section, la séquence des principales phases effectuée au cours de la procédure expérimentale et l’intervalle de temps suggéré est fourni (Figure 1). Par ailleurs, une description étape par étape du protocole est complétée par un panneau indicatif, montrant des actions critiques allant de l’enlèvement de cerveau d’homogénéisation des tissus après la période d’incubation (Figure 2). Les détails concernant les matériaux et les instructions pour construire l’appareil et la phase suivan....

Results

Le protocole présenté ici indique que l’administration d’un peptide toxique, T30, module, d’une manière liés au site, l’expression de α7-CNCDH, p-Tau et bêta-amyloïdes dans les parties contenant les BF (Figure 3 a). Le récepteur nicotinique montre une augmentation significative dans la hemislice rostral traités par rapport à son homologue de contrôle (tranche 1, p = 0,0310) (Figure 3 b), tandis que la tranche intermédiai.......

Discussion

Le principal aspect du présent protocole, basé sur la technique de cerveau bien établie ex vivo , permet de tester simultanément deux hemislices spéculaires, obtenus à partir d’un même plan anatomique, surveiller leur réponse après l’application d’une particulière condition (contrôler ou traités) ; Cela offre donc un paradigme expérimental contrôlé aussi étroitement que possible. La possibilité d’évaluer à un temps, dose et ponctuelle, de sorte différente neurochimiques liés à l’atteinte neuronale, comme on le v.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich, Allemagne	S7653	Réactif pour préparation d’aCSF
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich, Allemagne	P9333	Réactif pour préparation d’aCSF
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Sigma-Aldrich, Allemagne	S5761	Réactif pour préparation d’aCSF
Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4 (7H2O))	Sigma-Aldrich, Allemagne	63138	Réactif pour préparation d’un LCR d’un cac
clair de potassium monobasique (KH2PO4)	Sigma-Aldrich, Allemagne	P5655	Réactif pour la préparation d’un LCR d’un
Hepes	Sigma-Aldrich, Allemagne	H7006	Réactif pour la préparation
d’un acide de Hepes	Sigma-Aldrich, Allemagne	H3375	Réactif pour la préparation d’un CSF d’un
Glucose	Sigma-Aldrich, Allemagne	G7528	Réactif pour la préparation du LCR aChlorure
calcium déshydraté	Sigma-Aldrich, Allemagne	223506	Réactif pour la préparation
du peptide T30	Genosphere Biotechnologies, France		Peptide dérivé de l’AChE testé
Kit de dissection chirurgicale	World Precision Instruments, USA	Article # : MOUSEKIT	Étape d’ablation du cerveau
Lames chirurgicales	Swann-Morton, UK	BS 2982	Étape d’ablation du cerveau
Papier filtre	Fisher Scientific, USA	11566873	Préparation du cerveau pour le tranchage
Colle			Préparation du cerveau pour le tranchage
Vibratome	Leica, Allemagne	VT1000 S	Brosses à trancher
Manipulation			tissus
Cartouche			d’oxygènePhase de sectionnement et d’incubation
1x Tampon phosphate salin (PBS)	Fisher Scientific, USA	BP2438-4	Étape d’homogénéisation
Inhibiteurs de phosphatase	Fisher Scientific, USA	1284-1650	Étape d’homogénéisation
Inhibiteurs de protéase	Roche complete PIC, USA	Étape d’homogénéisation
Pestles	Starlab, UK	I1415-5390	Étape d’homogénéisation
Microcentrifugeuse
Pierce 660 nm Dosage des protéines	Thermo Scientific, USA	22660	Concentration en protéines