Å gjøre Testing og bruke kalium Ion selektive Microelectrodes i vev skiver av voksen hjernen

Summary

Kalium ioner bidrar til hvile membran potensialet i celler og ekstracellulære K⁺ konsentrasjon er en viktig regulator av mobilnettet excitability. Beskriver vi hvordan å gjøre, kalibrere og bruke monopolar K⁺-selektiv microelectrodes. Med slike elektrodene kan måling av elektrisk vakte K⁺ konsentrasjon dynamikk i voksen hippocampus skiver.

Abstract

Kalium ioner betydelig bidrar til hvile membran potensialet i celler, og derfor ekstracellulære K⁺ konsentrasjon er en viktig regulator av cellen excitability. Endret konsentrasjoner ekstracellulære K⁺ påvirker hvile membran potensial og mobilnettet excitability av skiftende likevekt mellom lukket, åpen og deaktivert for spenningen-avhengige ionekanaler som ligger til grunn for handlingen potensial initiering og gjennomføring. Derfor er det verdifullt å måle direkte ekstracellulære K⁺ dynamikk i helse og syke tilstander. Her beskriver vi hvordan å gjøre, kalibrere og bruke monopolar K⁺-selektiv microelectrodes. Vi satt dem i voksen hippocampus hjernen skiver å måle elektrisk vakte K⁺ konsentrasjon dynamics. Forstandig bruk av slike elektrodene er en viktig del av verktøysett for å evaluere mobilnettet og Biofysiske mekanismer som styrer ekstracellulære K⁺ konsentrasjoner i nervesystemet.

Introduction

Kalium ion konsentrasjoner er strengt regulert i hjernen, og deres svingninger utøver en mektig innflytelse på hvile membran potensialet i alle celler. I lys av disse viktige bidrag er et viktig mål for biologi å fastslå mobilnettet og Biofysiske mekanismene som brukes til å regulere tett konsentrasjonen av K⁺ på ekstracellulære plass i ulike organer av kroppen^{1 , 2}. et viktig krav i disse studiene er muligheten til å måle K⁺ konsentrasjoner nøyaktig. Selv om mange komponenter som bidrar til kalium homeostase i hjernen i friske og syke tilstander har blitt identifisert^3,4,5, har ytterligere fremgang blitt redusert på grunn av spesialiserte natur forbereder ion selektiv microelectrodes for kalium måling. Microelectrode sensorer representerer gullstandarden for måling K⁺ konsentrasjoner i vitro, vev skiver og i vivo.

Nyere metoder for K⁺ overvåking er under utvikling med optiske sensorer, men dette ikke oppdager en biologisk relevante utvalg av K⁺ konsentrasjoner eller har ikke blitt fullt sjekket i biologiske systemer, selv om resultatene vises lovende^6,7,8. Sammenlignet med optiske sensorer, er microelectrodes fundamentalt begrenset til en kilde måling av ioner, selv om elektroden matriser kan forbedre romlig oppløsning⁹. Denne artikkelen fokuserer på enkelt-barreled microelectrode sensorer for å overvåke K⁺ dynamics.

I dette arbeidet vi rapporterer detaljert gradvis prosedyrer å gjøre K⁺ selektiv microelectrodes, med en valinomycin-baserte kalium ionophore som tillater svært selektive (10⁴ brett K⁺ å Na⁺ selektivitet) K⁺ bevegelse over membraner¹⁰. En naturlig forekommende polypeptid, valinomycin fungerer som en K⁺ gjennomtrengelig pore og forenkler flyten av K⁺ ned den elektrokjemiske gradering. Vi beskriver hvordan å kalibrere elektrodene, lagre og bruke dem og til slutt hvordan du distribuerer dem til å måle K⁺ konsentrasjon dynamikk i akutt hippocampus hjernen skiver fra voksne mus. Bruk av slike elektroder med genmodifiserte mus som mangler spesifikke ionekanaler foreslått å regulere ekstracellulære K⁺ dynamics skal avsløre de cellulære mekanismene brukes av nervesystemet for å kontrollere ambient konsentrasjonen av K ⁺ i ekstracellulære miljøet.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til National Institute of helse Guide og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av kansler dyr forskningsutvalg ved University of California, Los Angeles. Alle mus ble plassert med mat og vann tilgjengelig annonsen libitum i 12 h lys og mørke omgivelser. Alle dyrene var friske med ingen åpenbare atferdsendringer, var ikke involvert i tidligere studier og ble ofret under lyset syklus. Data for eksperimenter ble samlet inn fra voksen mus (6-8 uker gammel for alle eksperimenter…

Representative Results

For selektiv måling ekstracellulære k+forberedt vi ion-selektiv microelectrodes belagt med et hydrofobe lag gjennom silanization av ren Borosilikatglass Pipetter (figur 1A). Dette belegg kan K+ ionophore som inneholder valinomycin for å hvile på spissen av elektroden og tillater bare K+ flux gjennom en smal åpning på elektroden spissen (figur 1B). Etter grunning elektrodene fylt saltvann og …

Discussion

Metoden som beskriver vi her har tillatt oss å vurdere K⁺ dynamics svar på elektrisk stimulering av Schaffer collaterals i akutt hippocampus skiver fra voksne mus. Vår metode for å forberede K⁺ ion selektive microelectrodes ligner på tidligere beskrevet prosedyrer^12,13,14,15. Denne metoden har imidlertid fordeler over alternative elektrode konfigurasjoner i at det er …

Materials

Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW