Att göra och testning med kalium Ion selektiv mikroelektroder i vävnad skivor av vuxna hjärnan

Summary

Kalium joner bidrar till vila membranet potential celler och extracellulära K⁺ koncentration är en viktig regulator av cellulära retbarhet. Vi beskriver hur man gör, kalibrera och använda monopolär K⁺-selektiv mikroelektroder. Med sådana elektroder kan mätning av elektriskt evoked K⁺ koncentration dynamics i vuxen Hippocampus skivor.

Abstract

Kalium joner bidra avsevärt till att vila membranet potential celler och extracellulära K⁺ koncentration är därför en avgörande regulator av cell retbarhet. Förändrad koncentrationer av extracellulära K⁺ påverkar vilande membranet potential och cellulära retbarhet av skiftande jämvikter mellan sluten, öppen och inaktiverade stater för spänningsberoende jonkanaler som ligger bakom aktionspotential initiering och överledning. Därför är det värdefullt att direkt mäta extracellulära K⁺ dynamik i hälsa och sjuka stater. Här beskriver vi hur man gör, kalibrera och använda monopolär K⁺-selektiv mikroelektroder. Vi distribuerade dem i vuxna Hippocampus hjärnan skivor att mäta elektriskt evoked K⁺ koncentration dynamics. Förnuftig användning av sådana elektroder är en viktig del av den verktygslåda som behövs för att utvärdera cellulära och biofysiska mekanismer som styr extracellulära K⁺ koncentrationer i nervsystemet.

Introduction

Kalium jonkoncentrationer är hårt reglerad i hjärnan, och deras variationer ett kraftfullt inflytande på vilande membranet potential av alla celler. Mot bakgrund av dessa kritiska bidrag är ett viktigt mål av biologi att bestämma de cellulära och biofysiska mekanismer som används för att ordentligt reglera koncentrationen av K⁺ i det extracellulära utrymmet i olika organ i kroppen^{1 , 2}. ett viktigt krav i dessa studier är förmågan att mäta K⁺ koncentrationer exakt. Även om många delar som bidrar till kalium homeostas i hjärnan i friska och sjuka har varit identifierade^3,4,5, har ytterligare framsteg minskat på grund av specialiserade förbereder ion selektiv mikroelektroder kalium mätning. Mikroelektrod sensorer representerar den gyllene standarden för att mäta K⁺ koncentrationer i vitro, i vävnad skivor och in vivo.

Nyare metoder för K⁺ övervakning är under utveckling med optiska sensorer, men dessa inte upptäcka en biologiskt relevant utbud av K⁺ koncentrationer eller har inte fullt prövats i biologiska system, även om de första resultaten visas lovande^6,7,8. Jämfört med optiska sensorer, är mikroelektroder fundamentalt begränsat till en punktkälla mätning av joner, även om elektroden matriser kan förbättra den rumsliga upplösning⁹. Denna artikel fokuserar på singel-barreled mikroelektrod sensorer för övervakning av K⁺ dynamics.

I detta arbete, Vi rapporterar detaljerad stegvis förfaranden för att göra K⁺ selektiv mikroelektroder, använder en valinomycin-baserade kalium jonofor som tillåter mycket selektiv (10⁴ faldigt K⁺ till Na⁺ selektivitet) K⁺ rörelse över membran¹⁰. En naturligt förekommande polypeptid, valinomycin fungerar som en K⁺ genomsläpplig por och underlättar flödet av K⁺ ner det är elektrokemiska gradient. Vi beskriver också hur du kalibrerar elektroderna, lagra och använda dem och slutligen hur du distribuerar dem för att mäta K⁺ koncentration dynamics i akut Hippocampus hjärnan skivor från vuxna möss. Användningen av sådana elektroder tillsammans med genetiskt modifierade möss som saknar specifika jonkanaler föreslog att reglera extracellulära K⁺ dynamics bör avslöja de cellulära mekanismer som används av nervsystemet för att styra omgivande koncentrationen av K ⁺ i den extracellulära miljön.

Protocol

Alla djurförsök har utförts i enlighet med nationella institutet för hälsa guiden för skötsel och användning av laboratoriedjur och godkändes av kanslerns djur forskningsutskottet vid University of California, Los Angeles. Alla möss var inrymt med mat och vatten tillgängliga ad libitum i 12 h ljus-mörk miljö. Alla djur var friska med inga uppenbara beteendeförändringar, var inte inblandade i tidigare studier och offrades under lätta cykeln. Data för experiment samlades in från vuxna möss (6-8 …

Representative Results

För selektiv mätning av extracellulära K+beredda vi jonselektiva mikroelektroder överdragen med ett vattenavvisande skikt genom silanisering av ren borosilikatglas pipetter (figur 1A). Denna beläggning kan den K+ jonofor som innehåller valinomycin för att vila på spetsen av elektroden och tillåta endast K+ flöde genom en smal öppning på elektroden spetsen (figur 1B). Efter grundning el…

Discussion

Den metod som vi beskriver här har tillåtit oss att bedöma K⁺ dynamics svar på elektrisk stimulering av Schaffer säkerheter i akut Hippocampus skivor från vuxna möss. Vår metod för att förbereda K⁺ ion selektiv mikroelektroder liknar tidigare beskrivna förfaranden^12,13,14,15. Denna metod har dock fördelar över alternativa elektrod konfigurationer i att det är…

Materials

Vibratome	DSK	Microslicer Zero 1
Mouse: C57BL/6NTac inbred mice	Taconic	Stock#B6
Microscope	Olympus	BX51
Electrode puller	Sutter	P-97
Ag/AgCl ground pellet	WPI	EP2
pCLAMP10.3	Molecular Devices	n/a
Custom microfil 28G tip	World precision instruments	CMF28G
Tungsten Rod	A-M Systems	716000
Bipolar stimulating electrodes	FHC	MX21XEW(T01)
Stimulus isolator	World precision instruments	A365
Grass S88 Stimulator	Grass Instruments Company	S88
Borosilicate glass pipettes	World precision instruments	1B150-4
A to D board	Digidata 1322A	Axon Instruments
Signal Amplifier	Multiclamp 700A or 700B	Axon Instruments
Headstage	CV-7B Cat 1	Axon Instruments
Patch computer	Dell	n/a
Sodium Chloride	Sigma	S5886
Potassium Chloride	Sigma	P3911
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S0751
D-glucose	Sigma	G7528
Calcium Chloride	Sigma	21108
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
valinomycin	Sigma	V0627-10mg
1,2-dimethyl-3-nitrobenzene	Sigma	40870-25ml
Potassium tetrakis (4-chlorophenyl)borate	Sigma	60591-100mg
5% dimethyldichlorosilane in heptane	Sigma	85126-5ml
TTX	Cayman Chemical Company	14964
Hydrochloric acid	Sigma	H1758-500mL
Sucrose	Sigma	S9378-5kg
Pipette Micromanipulator	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
Objective lens	Olympus	PlanAPO 10xW