Isolering og karakterisering af ekstracellulære vesikler fra voksen Schistosoma japonicum
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at beskrive ekstracellulære vesikler (EVs) isolation i in vitro- kulturperler medium fra voksen Schistosoma japonicum.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EVs) er hindeagtige vesikler udgivet af en række celler i den ekstracellulære mikromiljø. Evt repræsenterer en befolkning af heterogene vesikler, hvis størrelse varierer mellem 40 og 1000 nm. Akkumulerede beviser angivet at evt spiller en vigtig lovgivningsmæssig rolle i pathogen-værtssammenspil. En dyb forståelse af schistosome evt skal give indsigt i de underliggende schistosome-værtssammenspil, muliggør udviklingen af nye strategier mod Bilharziose mekanismer. Her, vi sigter mod at yderligere undersøgelse evt-funktioner i schistosomes ved at præsentere en protokol til isolering og karakterisering af evt fra voksen Schistosoma japonicum (S. japonicum). Evt blev isoleret fra in vitro- dyrkningsmediet ved hjælp af centrifugering kombineret med en kommerciel exosome isolering kit. Den isolerede S. japonicum evt (SjEVs) typisk har en diameter på 100-400 nm, og er karakteriseret ved transmission elektroniske mikroskopi og western blotting. Brugen af PKH67 dye-mærket SjEVs har vist, at SjEVs er internaliseret af de modtagende celler. Samlet set giver vores protokol en alternativ metode til at isolere evt fra voksen schistosomes; den isolerede SjEVs kan være egnet til funktionelle analyse.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EVs) er en befolkning på lille membran-bundet vesikler indkapslet med forskellige proteiner, lipider og nukleinsyrer. Nylige undersøgelser viste at evt spiller en afgørende rolle i celle-celle kommunikation, og er involveret i reguleringen af mange fysiologiske processer, herunder celle udvikling, immun forordning, angiogenese og celle migration2, 3,4,5. Akkumulere beviser indikerer at evt, cirkulerende exosomes, og deres miRNA last repræsenterer potentielle biomarkører for visse sygdomme6.
Flere protozoer såsom Trichomonas vaginalis, Trypanosoma cruziog Leishmania spp., har vist sig at være i stand til at udskille evt; helminter har desuden fundet at udskille evt i levende vært for7. Parasitære evt har vist sig at være deltager i vedligeholdelse af infektion, patogenicitet8og immun forordning9. Nylige undersøgelser i schistosomes både Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 og S. japonicum12 har tilkendegivet, at voksen schistosomes udskiller exosome-lignende blærer, der kan være involveret i de funktionelle bestemmelser i specifikke biologiske processer.
Til dato, er flere metoder blevet brugt til at isolere ekstracellulære vesikler, såsom ultracentrifugering, ultrafiltrering13, brugen af polymer-baserede reagenser, størrelse-udelukkelse kromatografi og immunoaffinity isolation. Disse forskellige metoder har deres egne fordele og begrænsninger14. Generelt anses ultracentrifugering metoden guldstandarden for vesikel isolation. Imidlertid lider denne metode begrænsning af potentielle EV sammenlægning14.
I schistosomes, et par metoder er blevet rapporteret til EV isolation: disse omfatter ultracentrifugering11,12,10 og anvendelse af kommercielle EV isolering kit16 til flere faser (æg16, schistosomula11, voksen schistosomes10,12,17). Microvesicles er af en bred vifte af størrelse fra flere hundrede nanometer til tusinde nanometer, udviklet vi en alternativ metode, der kombinerer med brug af bænken centrifuge, ultrafiltrering og en kommerciel EV isolering kit at isolere evt fra voksen Schistosoma japonicum. De isolerede evt typisk havde en diameter på 100-400 nm og blev med held internaliseret af de modtagende celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
De seneste undersøgelser af evt har demonstreret at schistosome evt spiller en vigtig rolle i vært-patogen interaktioner3,9,12,16. Til yderligere adresse deres regulerende funktioner, er det vigtigt at isolere evt fra schistosomes. Her beskriver vi en alternativ metode til SjEV isolation. Denne metode giver en bred vifte af SjEVs, størrelse fra 100 nm til 400 nm, i voksen S. japonicum</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse var delvist eller helt, støttet af National Natural Science Foundation of China (31472187 og 31672550) og landbruget videnskab og teknologi Innovation Program af det kinesiske Musikkonservatorium Jordbrugsforskning.
Materials
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 | |
References
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
- Riaz, F., Cheng, G. Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development. Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).
- Zhang, H. G., Grizzle, W. E. Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression. Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Li, Y., et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).
- Marcilla, A., et al. Extracellular vesicles in parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).
- Cwiklinski, K., et al. The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis. Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).
- Buck, A. H., et al. Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity. Nat Commun. 5, 5488 (2014).
- Sotillo, J., et al. Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates. Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).
- Nowacki, F. C., et al. Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni. J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).
- Wang, L., et al. Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage. Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).
- Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography. Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).
- Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319 (2015).
- Zhu, S., et al. Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum. Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).
- Zhu, L., et al. Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions. Sci Rep. 6, 25885 (2016).
- Lewis, F. Schistosomiasis. Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).
- Cheng, G. Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy. Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).
