Toeprinting analys av översättning inledande komplexa bildande på däggdjur mRNA
Summary
Toeprinting syftar till att mäta förmågan av in vitro transkriberade RNA till formuläret översättning inledande komplex med ribosomer under olika villkor. Detta protokoll beskriver en metod för toeprinting däggdjur RNA och kan användas för att studera både cap-beroende och IRES-driven översättning.
Abstract
Översättning inledande är det hastighetsbegränsande steget i proteinsyntesen och representerar en viktig punkt där celler reglerar deras protein produktion. Reglering av proteinsyntesen är nyckeln till cellulär stress-svar och dysreglering är central för många sjukdomstillstånd, exempelvis cancer. Exempelvis även om cellulär stress leder till hämning av globala översättning av förmildrande cap-beroende initiering, översätts vissa stressreaktionen proteiner selektivt på en cap-oberoende sätt. Diskret RNA reglerande faktorer, såsom cellulär intern Ribosomen inträde platser (IRESes), möjliggör för översättning av dessa specifika mRNA. Identifiering av sådana mRNA och karakterisering av regleringsmekanismerna, har varit ett nyckelområde i molekylärbiologi. Toeprinting är en metod för studier av RNA struktur och funktion som det avser den översättningen inledandet. Målet med toeprinting är att bedöma möjligheten av in vitro transkriberade RNA bildar stabila komplex med ribosomer under olika förhållanden, för att avgöra vilka sekvenser, strukturella element eller tillbehör faktorer är inblandade i Ribosomen bindande — en förelöpare för effektiv översättning inledande. Tillsammans med andra tekniker, såsom västra analys och polysome profilering, möjliggör toeprinting en robust karakterisering av mekanismer för reglering av översättningen inledandet.
Introduction
Som översättning förbrukar mest cellulär energi, är det vettigt att översättningen är hårt reglerade1. Omvänt, dysreglering av översättning- och de därav följande förändringarna i protein utdata-är ofta observeras i stressreaktionen och sjukdomar, såsom cancer1,2. En stor fördel med translationell kontroll är hastigheten med vilken celler kan förändra deras protein produktion för att möta olika stimuli3. Översättning förordning utgör därmed en viktig mekanism som kan påverka cellöverlevnad och död1,2,3. Av steg i översättning är inledande de flesta mycket reglerad och komplexa3. Kort, de flesta eukaryota mRNA innehålla en 5′ m7G cap som nästan alltid är avgörande för deras översättning. Cap-beroende initiering kräver eukaryota inledande faktorer eIF4E, eIF4A och eIF4G (cap-erkännande komplexet) att interagera med 5′ slutet av mRNA. 43S preinitiation Ribosomen komplex, som innehåller eIF2-bundna initieraren tRNA och eIF3, rekryteras 5′ ände till mRNA via växelverkan av eIF4G med eIF3. Den komplexa preinitiationskomplexet tros Skanna mRNA, understödda av eIF4A (en RNA helicase) tills den start-kodon (AUG) ligger. 48S inledande komplex bildas därefter och tRNA levereras in P-platsen av Ribosomen. Slutligen, 60S och 40S Ribosomen subunitsna förenas att bilda 80S inledande komplexa, följt av översättning töjning1,3,4. Däremot kringgå intern Ribosomen inträde platser (IRESes) krav för en 5′ cap genom att rekrytera den ribosomal subuniten för 40S direkt till den inledande kodon3. Fysiologisk stress villkor dämpa globala mRNA översättning på grund av ändringar av viktiga allmänna eukaryota inledande faktorer (gamla). Men icke-kanoniska översättning inledande mekanismer gör det möjligt för selektiv översättning av vissa mRNA som ofta kodar stressreaktionen proteiner och dysreglering av icke-kanoniska översättning inledande är inblandad i sjukdomstillstånd som cancer 1 , 2. diskret RNA reglerande faktorer, såsom cellulär IRESes, möjliggör för översättning av sådant mRNA2,3.
En särskilt intressant aspekt av translationell kontroll är att förstå mekanismerna för kanoniska kontra icke-kanoniska översättningen av en viss mRNA. Toeprinting är en teknik som möjliggör detaljerade mekanistiska studier av översättningen inledandet av specifika RNAs in vitro. Det övergripande målet för toeprinting är att bedöma förmågan hos en RNA av intresse att kärnbildas bildandet av en översättning inledande komplex med Ribosomen under olika förhållanden, för att avgöra vilka sekvenser, strukturella element eller tillbehör faktorer som krävs för effektiv översättning inledande. Ribosomen rekrytering kan exempelvis vara hindras i avsaknad av en 5′ cap men stimuleras av närvaron av en IRES.
Principen om tekniken är att in vitro transkribera en RNA av intresse, inkubera det i närvaro av cellulära extrakt som innehåller översättning komponenter (eller renade komponenter) för att tillåta inledande komplex form och omvänd transkribera RNA med en specifik primer. Stabil RNA-Ribosomen komplex kommer att orsaka omvänd Transkription till stall vid 3′ kanten av Ribosomen-den så kallade ‘toeprint’5,6,7.
I detta protokoll, ribosomal subenheter, gamla, tRNAs och IRES trans-agerar faktorer (ITAFs) är ett bekvämt bidragit med kanin retikulocyter lysate (RRL). En annan fördel med detta protokoll är användningen av en fluorescently-märkt primer och fluorescens gel-baserad imager, snarare än en radiomärkt primer. Detta eliminerar extra åtgärder, inklusive radiolabeling primer, samt torkning gelen och utsätta den för en allt intensivare skärm. De fluorescerande banden registreras i realtid, som gel körningarna, vilket möjliggör större upplösning. Icke-utjämnade X-länkade hämmare av apoptos protein (XIAP) IRES RNA används som exempel här, även om utjämnade mRNA kan också analyseras genom denna teknik8.
Till skillnad från västra analys, som mäter den slutliga utmatningen av översättningsprocessen i cellen lysates, är toeprinting en in vitro -metod att mäta översättning inledande komplexa bildande på ett RNA. Denna reduktionistiska strategi tillåter för mycket detaljerade studier av substrat eller faktorer som reglerar översättning inledande (t.ex., tak eller un-capped mRNA, IRES struktur, närvaro eller frånvaro av poly-A svans, tillhandahållande av särskilda protein faktorer, (se etc.). Toeprinting kan därför användas för att studera olika lägen av översättning8 eller effekterna av mRNA strukturer, såsom IRESes, på proteinsyntes9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting är en kraftfull teknik för att direkt mäta förmågan hos en RNA av intresse att stödja bildandet av översättning inledande komplex under mycket kontrollerade omständigheter. Det här protokollet beskriver en förenklad teknik för toeprinting däggdjur RNAs. Kanin retikulocyter lysate (RRL) används som en bekväm källa av ribosomer, gamla, initiativtagare tRNA och IRES trans-agerar faktorer (ITAFs). Experimentledaren ger deras RNA av val, och kan även komplettera den toeprinting reaktionen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av en naturvetenskaplig och teknisk forskning rådet till Kanada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), Stiftelsen Kanada för Innovation-John R. Evans ledare Fund (35017), Campus Alberta utvecklar programmet och Alberta ministeriet för Ekonomisk utveckling och handel.
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5′-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
