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Evaluación funcional salival murino mediante pilocarpina estímulo siguiente fraccionado radiación

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DOI:

10.3791/57522

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4 de mayo de 2018

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1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Otolaryngology, University of Rochester Medical Center, 3Center for Oral Biology, University of Rochester Medical Center

Autores correspondientes: Jomy J. Varghese <jomy_varghese@urmc.rochester.edu>, Danielle S.W. Benoit <danielleswbenoit@rochester.edu>, Catherine E. Ovitt <catherine_ovitt@urmc.rochester.edu>

En este artículo

Resumen

Presentamos un enfoque detallado para realizar la colección de saliva, incluyendo traqueotomía murino y el aislamiento de tres glándulas salivales mayores.

Resumen

Hiposalivación se observa comúnmente en la reacción autoinmune síndrome de Sjögren o siguiente lesión por radiación a las glándulas salivales mayores. En estos casos, quedan preguntas con respecto a la patogénesis de la enfermedad y las intervenciones eficaces. Una técnica optimizada que permite la evaluación funcional de las glándulas salivales es muy valiosa para la investigación terapéutica, disfunción y biología de la glándula exocrine. Aquí, presentamos un enfoque paso a paso para realizar la pilocarpina estimula la secreción de saliva, incluyendo la disección de las glándulas salivales murinas principales tres y traqueostomía. También detallamos la anatomía cabeza y cuello murina apropiada accedida durante estas técnicas. Este enfoque es escalable, permitiendo múltiples ratones ser procesados simultáneamente, mejorando así la eficiencia del flujo de trabajo. Nuestro objetivo es mejorar la reproducibilidad de estos métodos, cada uno de ellos tiene más aplicaciones en el campo. Además de la colección de saliva, discutimos métricas para cuantificar y normalización de la capacidad funcional de estos tejidos. Datos representativos se incluyen de las glándulas submaxilares con función deprimida de la glándula salival 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy).

Introducción

Trastornos de la glándula salival incluyen síndromes de altera o deteriora la secreción hacia la superproducción (sialorrea) o insuficiente (xerostomía e hiposalivación) de saliva1. En ambos casos, hay un interés por mejorar nuestra comprensión de la biología de la glándulas salivales hacia la meta final del desarrollo terapéutico2.

Las glándulas salivales son órganos altamente radiosensibles y a menudo se dañan durante la radioterapia de cáncer cabeza y cuello, hacia la permanente boca seca (xerostomía)3,4. Sin embargo, a diferencia de otros tejidos radiosensibles, índice de rotación de la glándula salival es relativamente baja, y el mecanismo de la pérdida de secreción es mal entendido5,6. En este escenario de lesiones únicas, estrategias de regeneración y protección radiológica de tejido requieren evaluación funcional salival. Experimentalmente, colección de saliva murino es una herramienta especialmente valiosa en la evaluación de la respuesta de la glándula a la radiación y los agentes terapéuticos.

Aquí, presentamos un método para realizar y cuantificar la secreción de saliva estimulada con pilocarpina, un potente agonista muscarínico7. La pilocarpina estimula el sistema nervioso autónomo para inducir la secreción de la glándula8,9. Para completar correctamente esta prueba, una traqueotomía se requiere para asegurarse de que el ratón mantenga una vía aérea patente durante todo el procedimiento y para reducir los riesgos de asfixia y aspiración de secreciones agrupadas en la cavidad oral10.

Este es un procedimiento terminal, culminando en la eliminación de las tres glándulas salivales mayores: parótida (PG), el submaxilar (SMG) y sublingual (SLG). Para los estudios funcionales, glándula pesos se registran y se utilizan a menudo para normalizar saliva medición11,12,13. Esta información es particularmente importante en estudios de radiación, en la que la atrofia de la glándula es un resultado esperado14,15

Hay variabilidad en la literatura con respecto a la secreción de saliva estimulada cómo se realiza y divulga16. Por ejemplo, dosis de pilocarpina en la literatura palmo por lo menos tres órdenes de magnitud17,18,19,20,21,22,23. Aquí, presentamos un protocolo de pilocarpina optimizado de dosis alta con la intención de mejora reproducibilidad en ejecución método, así como proporcionar una plataforma modular de técnicas (traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula) que pueden ser adaptados como necesario.

Además de la demostración del Protocolo, incluimos datos funcionales representativos de flujo de la saliva a las 2 semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy) a la región SMG.

Protocolo

Todo en vivo los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por el Comité de la Universidad sobre los recursos de la Universidad de Rochester, Rochester. NUEVA YORK.

1. preparación

  1. Utilizando una balanza analítica, pesan 20 mg de pilocarpina. Disolver en 2 mL de solución salina estéril en un tubo de microcentrífuga.
    Nota: Porque pilocarpina es sensible a la luz y pierde actividad con el tiempo, esta solución debe ser preparada el día de la inyección y protegida de la luz hasta que administra.
  2. Utilizando una balanza analítica, pesar e identificar todos los tubos y capilares de vidrio. El número de tubos y capilares de vidrio debe coincidir con el número de ratones.

2. traqueostomía

  1. Pesar ratones C57/BL6 utilizando una balanza analítica.
  2. Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", anestesiar ratones con una solución salina estéril inyectada por vía intraperitoneal de 100 mg/kg ketamina y 10 mg/kg xilacina. Proceder al paso siguiente cuando el ratón deja de responder a los estímulos (es decir, ausencia del reflejo pedal retirada), que ocurre generalmente dentro de 5 a 10 minutos después de la inyección.
  3. Después de dispensar lubricante en un aplicador con punta de algodón, suavemente aplique a los ojos y coloque el ratón en una posición supina en el escenario. El animal anestesiado debe mantenerse en la superficie caliente.
    Nota: Todas las medidas se realizan a temperatura ambiente.
  4. Asegure la nariz, extremidades y cola a la etapa con cinta quirúrgica.
  5. Limpiar y mojar el cuello con un algodón empapado en alcohol.
    Nota: Esto ayudará a prevenir la piel entren en incisiones posteriores.
  6. Levantando la piel del cuello del midline ventral con pinzas, hacer un corte pequeño y superficial con tijeras de disección. Guía de las tijeras en la abertura y abra lentamente las hojas por vía subcutánea para separar tejidos planos.
  7. Mantener la piel levantada, cuidadosamente corte a 1 cm por debajo de la boca.
  8. Hacer dos incisiones laterales en los aspectos inferior y superiores del primer corte. Suavemente con unas pinzas, reflejan a la piel para permitir el acceso a las estructuras de cabeza y cuello.
  9. Usando el microscopio de disección con 8 aumentos, visualizar las glándulas submaxilar (media: figura 1).
  10. Con unas pinzas finas, levante suavemente las glándulas para exponer los cuatro músculos del infrahyoid (correa) que cubre la tráquea. Evitar desgarros o interrumpir la vasculatura circundante o conductos excretores.
  11. Si recoger saliva de más de un ratón, repita los pasos 2.1-2.10 con cada ratón antes de continuar.
    Nota: Este procedimiento puede realizar con seguridad en hasta 5 ratones al mismo tiempo.
  12. Con pequeñas tijeras de disección, quitar la porción medial de los músculos de la correa durante su estancia lo más cerca posible de la línea media. Corte solamente tanto como sea necesario visualizar la tráquea y mantener los músculos de la correa del camino durante el procedimiento. Evitar mellar cualquier buques cercanos porque si hay depleción de volumen secundaria a hemorragia significativa, pilocarpina no será eficaz en la inducción de secreción.
  13. Reflejo de los músculos de la correa de la tráquea.
  14. Visualizar la laringe, la tráquea y la glándula tiroides. Asegúrese de que la tráquea esté libre de tejido sobrepuesto.
  15. Hacer una incisión horizontal en la tráquea inferior posterior de la tiroides usando pequeñas tijeras de disección. Asegurar la vía aérea patente y claro del líquido.

3. saliva colección

  1. Retire la cinta junto a la boca y el ángulo de fase de disección hacia abajo (45°, cranially) para ayudar a flujo de la saliva.
  2. Utilizando una jeringa de 0.5 mL con aguja 29 x ½", realizar la inyección intraperitoneal de 10 μl/g cuerpo peso la pilocarpina para una dosis total de 100 mg/kg.
  3. Iniciar un temporizador. Si la dosis múltiples ratones, reducir tiempo moviendo rápidamente y por tener un ayudante inyecta simultáneamente los ratones restantes.
  4. Con unas pinzas estándar, abrir la boca para el acceso del tubo capilar.
  5. Una vez que se observa una gota de saliva en la boca, coloque el extremo proximal del tubo capilar en el líquido, con el extremo distal se coloca en un tubo colector colocado debajo de la etapa de disección (ambos tubos previamente pesados).
    Nota: En los ratones hembra C57/BL6 6-10 semanas de edad, bruta salivación ocurre dentro de 2 minutos de la inyección de pilocarpina.
  6. Si saliva en la boca del edificio, pero no fluye a través del tubo, reintentar el paso anterior. Asegúrese de que el tubo no esté directamente contra una superficie mucosa, que puede obstruir la entrada.
  7. Recoger saliva para un total de 12 minutos después del estímulo la pilocarpina. Asegúrese de que el estoma permanece claro.
    Nota: Aumento del volumen tidal y secreciones (salivales, urinarias, fecales) son normales durante este tiempo.
  8. Si los ratones han presionado función de saliva (ej., debido a lesión o intervención), transferir el líquido restante de la boca en el tubo de la colección mediante una micropipeta de P200. Si recogida de varios ratones, asegúrese de que los consejos han cambiado.
  9. Registrar el peso de saliva recogida más tubos 12 min después de la inyección de pilocarpina.

4. glándula disección

  1. Eutanasia a ratones por CO2 eutanasia (como se describe en las pautas de AVMA de eutanasia de los animales: edición 2013) seguido de toracotomía, teniendo cuidado de preservar las estructuras de la cabeza y el cuello. Por esta razón, evitar la dislocación cervical como método de eutanasia.
  2. Coloque el ratón en una posición supina en el escenario. Vuelva a colocar las glándulas en el sitio original sobre la tráquea (figura 1).
  3. Utilizando un microscopio de disección bajo 8 aumentos, visualizar las glándulas principales: el PG, SMG y SLG. Para distinguir las glándulas durante la disección, identificar que el PG es difusa, lateral a la SMG y SLG.
    Nota: Si el PG de disección, esto debe hacerse en primer lugar porque es el menos definido y más probable ser rasgado.
  4. Agarre la cola de la PG con pinzas, tirando lejos de las estructuras subyacentes y suavemente aplique tensión antes de cortar la cabeza de la PG con tijeras de disección.
  5. Incumplimiento la cápsula que rodea el metralletas con unas pinzas. Separe suavemente el SMG de izquierda y derecho.
  6. Libre de la cara dorsal de la SMG del tejido nonglandular adherido con unas pinzas.
  7. Retire el SMG del cuello tenso del conducto de Wharton con pinzas y corte el tubo con tijeras de disección.
  8. Separe suavemente el SLG de SMG con unas pinzas.
    Nota: La SLG es en el aspecto superolateral del SMG.
  9. Con una balanza analítica, registre pesos SMG.

Resultados

Cuando realizar pilocarpina dosis altas estimula la colección de saliva, es importante mantener la vía aérea para prevenir la aspiración o asfixia de las secreciones en la cavidad bucal. Un esquema de la traqueotomía se proporciona (figura 1). Tras la incisión traqueal, el estoma debe permanecer claro de tejido y fluidos.

Para mejorar la acción capilar durante la recogida de saliva, ratones deben colocarse con la cabeza hacia abajo en un ángulo de 45°. Estos pasos pueden realizarse en > 1 ratón, aunque se recomienda no exceder 5 ratones a la vez (figura 2). Una vez se ha completado la colección, se recomienda que los tubos se pesa rápidamente para evitar las pérdidas por evaporación.

Siguiendo la colección de saliva, ratones son sacrificados. Dislocación cervical no debe realizarse, ya que puede dañar las estructuras de cabeza y cuello. Ratones se devuelven a la etapa de disección, y las glándulas deben reposicionarse en la tráquea, como originalmente situado. Disección de la glándula (figura 3) debe comenzar con el PG, debido a su posición y consistencia difusa. La SMG SLG son firmes y pueden ser quitados fácilmente.

Después de 4 fracciones de 6.85 de Gy de radiación en SMG murino, función de la saliva disminuye significativamente por 2 semanas (figura 4). Ambos total de secreción de saliva y secreción normalizada para peso húmedo de la glándula se trazaron. Usando cualquier métrica, capacidad funcional salival es reducido, como se esperaba, a las 2 semanas tras la irradiación24.

Tejido de la glándula puede ser fijas y seccionadas para manchas histológicas o inmunohistoquímica. Hematoxilina y eosina tinción (H & E) muestran similar bruto arquitectura SMG con o sin estimulación de pilocarpina (figura 5). Coloración para Nkcc1, un transportador de cloruro de sodio potasio de la membrana, muestra similar morfología celular independientemente de la estimulación de la pilocarpina (figura 6).

Diagrama de autopsia de roedores, que expone las ubicaciones del corazón y el cerebro; Ilustración anatómica para investigación.
Figura 1 . Traqueostomía PDF. (A) después de abrir la región del cuello, visualizar las estructuras principales. (B) para completar una traqueotomía, suavemente Levante, pero no separes las metralletas sin afectar estructuras vecinas, incluyendo irrigación sanguínea, inervación y conductos excretores. Cortar los músculos de la correa para exponer el cartílago traqueal antes de realizar una incisión en la tráquea. Deje el SMG y tráquea expuesta durante el procedimiento de recogida de saliva entera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Configuración de experimentos con animales con tubos de recolección de fluidos e iluminación para análisis fisiológicos.
Figura 2 . Colección de saliva. Tras estimulación de pilocarpina, ángulo ratones hacia abajo y recoger la saliva a través de tubos capilares en tubos previamente pesado, que se colocan por debajo de la etapa de disección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagrama de anatomía de la glándula salival de rata; etiquetado SLG, SMG, PG; recurso de biología educativa.
Figura 3 . Disección de la glándula salival de mayor. Una vez que los ratones han sido sacrificados, vuelva a colocar y separar el SMG de izquierda y derecho. Con cuidado separar cada glándula que rodea los vasos sanguíneos y tejidos nonglandular. El PG es una estructura difusa, lateral. El SMG y el SLG se unen, pero pueden separarse limpiamente con el fórceps. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráfico de barras que compara el volumen de saliva y el peso de la glándula con el efecto de irradiación.
Figura 4 . Datos de secreción representante. Dos semanas después de la radiación fraccionada (4 dosis de 6.85 Gy) al SMG, se midió la secreción de la saliva estimula pilocarpine. Función salival se divulga como volumen total de saliva (A) y el volumen total de saliva (B) normalizaron a SMG peso húmedo total. Como era de esperar, hay una disminución significativa en la capacidad funcional de la SMG (media ± SD **p < 0.01 con dos colas t-test). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Comparación histológica de secciones pancreáticas con y sin pilocarpina; Análisis microscópico de imágenes.
Figura 5 . Hematoxilina y eosina SMG tinción. Tejido SMG fue cosechado de un ratón después de la estimulación de la pilocarpina (100 mg/kg, derecha) en comparación con el control, sin tratamiento ratón SMG (izquierda). H & E tinción muestra estructura de glándula bruto en 10 X (barras de escala: 200 μm) (A, B) y 40 X (barras de escala: 50 μm) (C, D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Imágenes de microscopía de fluorescencia que comparan tejido con y sin tratamiento con pilocarpina; estructura celular.
Figura 6 . Inmunohistoquímica SMG Nkcc1. Tejido SMG fue cosechado de un ratón después de la estimulación de la pilocarpina (100 mg/kg, derecha) en comparación con el control, sin tratamiento ratón SMG (izquierda). Nkcc1 es una proteína de membrana y puede ser utilizado para evaluar la morfología celular. DAPI se utiliza como una contratinción nuclear (barras de escala: 75 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Presentamos un método de varios pasos para evaluar la función de la glándula salival, que puede ser aplicada para el estudio de lesiones de la glándula y terapéutica. Nuestro procedimiento consiste en traqueostomía, la recolección de saliva y disección de la glándula, que tiene aplicaciones experimentales que soporten un estudio integrado de la biología de la glándula salival. Por ejemplo, traqueotomía murino se ha utilizado para la gestión general de la vía aérea durante procedimientos de obstrucción de la cavidad bucal.

Adecuada disección y la incisión traqueal se requieren para la pilocarpina estimula la secreción de saliva en 100 mg/kg. Alternativamente, una dosis de pilocarpina reducido podría evitar la necesidad de traqueostomía y por lo tanto ser utilizada para la evaluación longitudinal de la secreción de saliva16.

Además de registrar la secreción de saliva, este protocolo proporciona un medio preciso y consistente para recoger saliva para análisis adicionales. Dichos estudios incluyen la reología, proteómica, actividad enzimática, saliva osmolaridad25,26,27y descubrimiento de biomarcadores28,29.

Finalmente, métodos de disección estándar para las glándulas salivales principales tienen utilidad más allá de la colección de saliva. Hay un interés por comprender el desarrollo de la glándula y la respuesta a la lesión. Para investigaciones efectivas, es importante realizar disecciones consistente, limpias de las glándulas salivales mayores. Limpieza y aislamiento de glándula eficiente es crítico para cultivos derivados de células primarias que son mecánica y enzimáticamente disociadas de las glándulas salivales mayores30,31y para histologic e immunohistochemical preparativos. Por otra parte, cuando la coloración de proteínas secretadas en secciones del tejido de la glándula, es fundamental considerar y controlar para el probable agotamiento de estos productos tras la colección de saliva estimulada.

Cuantificación de la función de la glándula salival en las investigaciones de lesiones o la intervención es una técnica experimental vital. Histología de la glándula es informativa y puede provocar observaciones claves, sin embargo conclusiones mejor son apoyadas por datos claramente funcionales.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de odontología y el Instituto Nacional de cáncer (NCI) de los institutos nacionales de salud Premio número R56 DE025098, DE027695 UG3 y F30 CA206296 Craniofacial Research (NIDCR). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud. Este trabajo también fue apoyado por la NSF DMR 1206219 y la innovación de la IADR en Premio de Cuidado Oral (2016).

Nos gustaría agradecer al Dr. Eri Maruyama y Andrew Hollomon su asistencia con la colección de saliva. Nos gustaría agradecer su ayuda con la disección de la glándula Weng Pei-Lun. Nos gustaría agradecer a Matthew Ingalls por su ayuda en la preparación de la figura. Nos gustaría agradecer al Dr. Elaine Smolock y Emily Wu lectura crítica de este manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Clorhidrato de pilocarpinaSigma AldrichP6503Pilocarpina
Student Vannas Tijeras de resorteFine Science Tools91500-9Tijeras de resorte para traqueostomía
Solución salina estérilMedlineRDI30296H solución salina
Dumont #7 Pinzas FineScience Tools11274-20Pinzas curvas Pinzas
Dumont #5Fine Science Tools11251-10Pinzas
Pinzas de patrón estándarFine Science Tools11000-12Pinzas romas
Tijeras finas- carburo de tungstenoFine Science Tools14568-09Tijeras de disección
Microhematocrito Tubos capilares heparinizadosFisher Scientific22362566Tubos capilares
Ungüentolubricante para los ojosRefreshN/ARefresh Lacri-Lube
Goat polyclonal anti-Nkcc1Santa Cruz BiotechSC-21545Nkcc1 Anticuerpo
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroclorhidrato)Thermo Fisher ScientificD1306DAPI
GraphPad PrismaGraphPadver6.0Software estadístico
Aplicador con punta de algodónMedlineMDS202000Aplicador para ungüento ocular
0.5cc Jeringa de insulina, 29G x 1/2"BD7629Jeringa para inyección intraperitoneal
rectas

Referencias

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