Görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik CD1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma Transcriptomic entegre
Summary
Akış Sitometresi Imaging hücreleri, bireysel ve populational düzeyde morfolojik ve fonksiyonel İLETİMLERİNİZE algılamak için ideal bir yaklaşım sağlar. Kirletici günese maruz kalan insan dendritik hücrelerinde lipid antijen sunumu için kesintiye endositik işlevi bir kombine transcriptomic gen ekspresyonu ve protein ticareti morfolojik gösteri profil oluşturma ile gösterilmiştir.
Abstract
Populational morfolojik ve fonksiyonel değişikliğin endositik proteinlerin populational düzeyde bir tek hücre düzeyi ve istatistiksel görüntü analizi, görüntü yakalama talebi nedeniyle zorlu analizlerdir. Bu zorluk üstesinden gelmek için biz görüntüleme akış sitometresi ve transcriptomic (RNA-seq) profil oluşturma ilişkili değişmiş hücre altı yerelleştirme farklılaşma 1 d protein (CD1d) kümenin belirlemek için Engelli endositik gen ifade insan ile kullanılan ortak lipofilik sinin dendritik hücreler (DCs), kirletici benzo [a] dumanında hava. Colocalization CD1d ve endositik işaret Lamp1 proteinler akış sitometresi Imaging ile yakalanan hücre görüntüleri binlerce fikir ve ImageJ-Fiji kullanılarak analiz programları. Hücresel görüntülerle çok sayıda ortak lekeli CD1d ve Lamp1 proteinleri CD1d üzerinde Perdeleme sonra görüntülenir+Lamp1+ DCs fikirler kullanarak. Pozlama daha da thresholded scatterplots, kullanarak ortak yerelleştirilmiş yoğunluğu için Mander’ın katsayıları ile test edilmiş ve çizilen gösterilmiştir BaP üzerine geliştirilmiş CD1d ve Lamp1 colocalization ImageJ-Fiji kullanarak ortak lokalize alanlarda yüzde tabanlı. Protein colocalization, kirletici günese maruz kalan insan transcriptomic değişiklik Engelli fonksiyonel sonuç destekleyen tek ve populational hücresel düzeyde ölçmek için avantajlı bir enstrümantal ve bioinformatic yaklaşım bizim veri sağlamak DCs.
Introduction
Antijen sunumu genelde kez morfolojik karakterizasyonu ve fenotipik antijen sunan hücreler1,2,3 profil oluşturma kullanarak soruşturma kaçakçılığı, hücre içi protein içerir . Görüntüleme ve fenotipleme yöntemleri avantajları birleştirmek için bir görüntüleme analizi platform tek hücre ve bir değişmiş protein colocalization insan dendritik hücreler (DC) olarak göstermek için nüfus düzeyleri açıklanmaktadır. Peptid antijen sunumu, MHC kompleksi (MHC) sınıf ı molekülleri kısa peptid (8-10 artıkları) endoplazmik geleneksel CD8 etkinleştirmek için bağlamak+ T hücreleri, MHC sınıf II moleküller nispeten daha uzun bağlamak iken peptid (~ 20 artıkları) geleneksel CD4 etkinleştirmek için endositik bölmeleri içinde+ T hücreleri1,4. Buna ek olarak, lipid özgü T hücreleri CD1 proteinler tarafından ağırlıklı olarak endositik bölmeleri5,6‘ yüklü lipid antijenleri ile aktif hale gelir. Lipid antijen sunumu lipid metabolizma7,8,9,10 ve fonksiyonel lipid metabolitleri CD1 proteinler için yüklenmesini üretilen lipid metabolitleri temini gerektirir endositik bölmeleri5,6. Bu bağlamda, özellikle de lipofilik kirleticiler ve bağışıklık bozuklukları, çevresel maruz lipid antijen sunumu oransal çeşitli hücresel tanımlanması için kritik faktörlerdir. Bu çalışmada, biz transcriptomic analizi, görüntü profil oluşturma ve insan monosit kaynaklı DCs hücresel ve populational görüntüleme analizi lipid antijen sunumu kirletici maruz katkıda endositik protein kaçakçılığı belirlemek için kullanılır. Kesinlikle, bu Birleşik platform hücre altı protein trafiği ve colocalization farklı biyolojik süreçlerin, eğitim için uygulanabilir.
Teknik olarak, hücre altı protein yerelleştirme genellikle confocal mikroskobu kullanarak ve istatistiksel analiz algılanan hücreleri1,2,3,11sınırlı sayıda içinde gösterilmiştir. Ayrıca, akış sitometresi geniş bir hücresel düzeyde12birden çok proteinlerin Co lekeli sinyallerle kapısı hücre popülasyonlarının uygulandı; Ancak, bu hücre altı protein colocalization detaylı bir görselleştirme eksik. Yüzde protein colocalization, hücresel ve nüfus düzeyde kapsamlı ve istatistiksel analizlerini elde etmek için protein colocalization ile biyolojik özelliklerini belirlemek için profil oluşturma ve çözümleme yaklaşımlar görüntüleme dahil alaka. Özellikle, colocalization, CD1d ve ilişkili lizozomal membran proteini 1 (Lamp1) algılamak için görüntüleme akış sitometresi kullanır Bu çalışmada proteinler. Kantitatif analiz colocalized moleküllerin daha önce populational bir ölçekte yapılması zordu. Bu çalışmada, ImageJ-Fiji program protein colocalization ile çok sayıda populational ve bireysel hücresel düzeyde işbirliği lekeli hücre yüzdesi incelemek için uyarlanmış. Özellikle, biz birlikte lokalize alanlarda, yoğunluk ve CD1d protein büyük ölçüde insan DC’lerin lipofilik kirletici benzo [a] dumanında (BaP)13 maruz geç endositik bölmeleri içinde muhafaza edildi sonuç desteklemek için populational boyutu ölçülür . Bu kombine cep ve analiz görüntüleme nüfus CD1d-Lamp1 colocalization Inhibe lipid antijen sunumu için ilgili son derece tekrarlanabilir, kapsamlı ve istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar sağladı.
İnsan DCs BaP maruz transcriptome endositik lipid metabolizması ve CD1d endositik kaçakçılığı BaP pozlama Engelli hipotez kuvvetle desteklediler. Bu hipotezi test etmek için biz CD1d, endositik işaretleri ve DC işaretleri de dahil olmak üzere birden çok proteinler ile birlikte lekeli görüntüleri DC nüfusunun profil görüntüleme akış sitometresi uygulanır. Son olarak, ortak lekeli hücreleri istatistiksel olarak yoğunluk yüzdesi ve CD1d ve Lamp1 colocalization alanları göstermek için analiz edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fonksiyonel onay döngüsünün bir değişmiş gen içeren birden çok yolları ve bireysel ve populational hücresel aktiviteler tümleştirmek için zorluk yaygın olarak etkilenen gen ekspresyonu nedeniyle meydan okuyor. Özellikle test CD1d endositik bölmeleri kaçakçılığı görüntüleme akış sitometresi çalıştırmaya başladık. Akış Sitometresi Imaging hücre populational ölçüm ve birden çok proteinlerin hücre altı colocalization bireysel gösterimi bütünleştirir. Confocal mikroskobu daha ön…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Robert Giulitto (Hoxworth kan Merkezi) insan kan örnekleri için teşekkür ederiz ve Dr Liang Niu gen ekspresyonu normalleştirme için okur. Biz de teşekkür hibe destek üzerinden Ulusal Çevre Sağlık Bilimler Enstitüsü (ES006096), Merkez çevre genetik (CEG) pilot proje için (S.H.), Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları (AI115358) (S.H.), University of Cincinnati Üniversitesi Araştırma Konseyi Ödülü (S.H.) ve University of Cincinnati üniversite tıp çekirdek geliştirme fon (X. Z.).
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
References
- Roche, P. A., Cresswell, P. Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells. Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).
- Huang, S., et al. MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells. The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).
- Nakamura, N., et al. Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling. Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Zajonc, D. M., Kronenberg, M. CD1 mediated T cell recognition of glycolipids. Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).
- Cox, D., et al. Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules. PloS one. 4 (5), e5325 (2009).
- Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments. Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).
- Huang, S., et al. Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).
- de Jong, A., et al. CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens. Nature. 15 (2), 177-185 (2014).
- Trombetta, E. S., Mellman, I. Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo. Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Sharma, M., et al. Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants. Science Reports. 7 (1), 2085 (2017).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
- Nachamkin, I., et al. Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene. Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).
- Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems. Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).
- Bauer-Mehren, A. Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape). Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).
- Cline, M. S., et al. Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape. Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).
- Huang, S., Moody, D. B. Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system. Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).
- Huang, S. Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis. Frontiers in immunology. 7, 594 (2016).
- Moody, D. B., Porcelli, S. A. Intracellular pathways of CD1 antigen presentation. Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9 (7), 676-682 (2012).
- Diard, M., et al. Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype. Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).
- Bader, E., et al. Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans. Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature. 9 (7), 697-710 (2012).
- Costes, S. V., et al. Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells. Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).
