Burada, homojen mevcut zaman hücrelerden salgılanan insülin hızlı algılama için etkili bir yöntem olarak FRET (HTRF) çözüldü.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi tabanlı tahlil insülin salgılanması algılanması için
Bu makalede
Özet
Özet
İnsülin salgılanması tespiti düzenlenmiş salgılanmasını de çalışmalar olduğu gibi metabolizma elucidating mekanizmaları için önemlidir. Çok sayıda insülin deneyleri yıllardır varmışsın, homojen zaman çözüldü Förster rezonans enerji transferi (HTRF) teknolojisi son gelişiyle önemli ölçüde bu ölçümler basitleştirdi. Bu hızlı, uygun maliyetli, tekrarlanabilir ve güçlü optik tahlil zaman çözüldü Förster enerji rezonans Transfer kolaylaştırır uzun süreli emisyon ile parlak fluorophores için Birleşik antikorları üzerine bağımlı olduğunu. Ayrıca, HTRF insülin algılama yüksek üretilen iş tarama testleri geliştirme için mükellef olduğunu. Burada HTRF insülin salgılanması INS-1E hücrelerde, bir sıçan insülinoma türetilmiş hücre kültürünü algılamak için kullanır. Bu bize Bazal düzeyde insülin ve glikoz stimülasyon cevaben yaptıkları değişiklikleri tahmin etmek izin verir. Buna ek olarak, bu insülin algılama sistemi dopamin rol glikoz uyarılmış insülin salgılanması (GSIS) negatif bir düzenleyici olarak onaylamak için kullanın. Benzer bir şekilde, diğer dopamin D2-reseptör agonistleri, quinpirole ve bromokriptin, GSIS bir konsantrasyon bağımlı şekilde azaltmak gibi. Sonuçlarımız HTRF insülin tahlil biçiminin GSIS ve farmakolojik kendi profilleri çok sayıda uyuşturucu rolünü belirlemede yardımcı programı vurgulayın.
Giriş
Enerji metabolizmasının büyük bir anabolik hormon tarafından insülin ince ayar. İnsülin sentezlenmiş ve yanıt olarak artan hücre dışı şekeri pankreas beta hücreleri tarafından yayımlanan. Yayımlanan insülin glukoz alımını insülin duyarlı dokular1,2tarafından tetikler. Fizyolojik açıdan, bu glikoz konsantrasyonu glukoz alımını düzenleyen insülin salgılanmasını tarafından takip bir yemekten sonra yükselmesine bağlı olduğu. İnsülin direnci ile sonuçlanan metabolik bozukluklar glikoz homeostazı bozuklukları neden olabiliyor ve sonuçta, tip 2 diyabet2,3
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. INS-1E hücreleri: bakım ve kaplama
- INS-1E hücreleri oksijen 37 ˚C/5% CO2 kuluçka ve kültürlü RPMI 1640 orta ile %5 (v/v) ısı inaktive fetal sığır serum ile 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM sodyum pyruvate, 100 U/mL penisilin/streptomisin takıma korumak çözüm, 50 µM β-mercaptoethanol. 10 mL tam RPMI 1640 orta (plaka), başına hücrelerde kültür % 80-90 izdiham ulaşana kadar ne zaman onlar trypsinized ve pasajlı veya insülin salgısı tahlil için kullanılan.
- 1. gün: Medya Aspire edin ve hücreleri bir kez 5 mL de önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Tripsin (% 0,025) 0.5 mL 1:1 0.5 ml hücreleri trypsinize ve 3-4 dk 37 ˚C az....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Biz bizim insülin HTRF tahlil önceden tanımlanmış konsantrasyonları (Şekil 2) saf insan insülin Standartlar kullanılarak bir insülin standart eğri üreterek geçerliliği. Üretimi ratiometric floresan okuma ulaşmak için bize izin verilen standart eğri ve bu nedenle ilaç tedavileri (Şekil 2) yanıt olarak salgılanan insülin düzeylerini belirlemek. Intraplate değişim eğrisi montaj için en az (R2 0.99996 ± 5.0 x 10
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan HTRF insülin tahlil insülin salgılanması kültürlü hücre tabanlı sistemden ölçmek için hızlı, verimli bir sistem sunmaktadır. En önemli avantajları arasında bu tahlil yüksek sinyal gürültü oranı nedeniyle düşük arka plan sinyal sunmaktadır. Buna ek olarak, biz HTRF sinyal uzun bir süre için kararlı olduğunu doğruladı (> 24 h)7. Yine de, insülin bağlama monoklonal antikorlar, hızlı bir şekilde tahlil için ek sonra bağlama doygunluk ulaşmak beri Kinetik antikor bağlama ortam sıcaklığ.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Biz Nicolas Pierre (Cisbio BİYOANALİZLER) için faydalı tavsiyeler ve Dr. Pierre Maechler (Cenevre Üniversitesi) cömertçe INS-1E hücreleri verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bu eser Savunma Bakanlığı (grant PR141292 Z.F. için) ve John F. ve Nancy A. Emmerling Fonu (için Z.F.) Pittsburgh Vakfın fon tarafından desteklenmiştir.
Teşekkürler
Yazarlar ifşa gerek yok.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 oyuklu beyaz yarım alan plakası | Greiner Bio-One | 82050-042 | |
| 384 oyuklu beyaz düşük hacimli, yuvarlak tabanlı plaka | Corning | 15100157 | |
| İnsülin Yüksek Menzilli Kiti | Cisbio Biyotahliller | 62IN1PEH | 10.000 test HTRF bazlı insülin test kiti |
| PHERAstar FSX plaka okuyucu | BMG Labtech | FSX | HTRF tabanlı tahlil okumaları için uyarlanmış plaka |
| okuyucu Plaka kapatıcılar | Fisher Scientific | DY992 | Antikorlar inkübe edilirken plakayı mühürlemek için |
| Hemositometre | Hausser Scientific 3100 | ||
| RPMI Orta 1640 (1x) | Gibco | 11875-093 | [+] L-glutamin |
| Tripsin% 0.05 & nbsp; | Corning | 25-052-CI | 0.53 mM EDTA, (-) sodyum bikarbonat |
| DPBS (Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu) | Corning | 21-031-CV | Kalsiyum ve magnezyum olmadan |
| Fetal Sığır Serumu | Corning | 35-010-CV | |
| HEPES | Gibco | 156-30-080 | |
| Sodyum piruvat | Gibco | ||
| Penisilin / Streptomisin çözeltisi 100x | Corning | 30-002 CT | |
| 2-merkaptoetanol | Sigma | M1348 | |
| Tripan Mavi Leke (% 0.4) | Gibco | 15250-061 | |
| Dopamin hidroklorür | Sigma | 8502 | |
| Bromokriptin mesilat | Tocris | 427 | |
| (-) -Quinpirole hidroklorür | Tocris | 1061 | |
| Sığır Serum Albümini | Calbiochem | 12659 | |
| Poli-L-Lizin | Sigma | P4832 | |
| Glikoz | Sigma | G7021 | |
| DMSO (Dimetil sülfoksit) | Sigma | 276855 |
Kaynaklar
- Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. Critical nodes in signalling pathways: Insights into insulin action. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (2), 85-96 (2006).
- Vetere, A., Choudhary, A., Burns, S. M., Wagner, B. K. Targeting the pancreatic beta-cell to treat diabetes. Nat R....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
