والهدف من هذا البروتوكول هو رصد سبيكتروفوتوميتريكالي البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل الاستفادة من المتقبلين للإلكترون خارج الخلية وتحليل التفاعلات الانزيمية التي قد تحدث مع هذه متقبلون الإلكترون خارج الخلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البلازما عبر غشاء الإلكترون النقل (تبميت) يلعب دوراً في حماية الخلايا من الإجهاد التخفيض داخل الخلايا، فضلا عن الحماية من الأضرار بالخلية للتأكسد. هذه العملية لنقل الإلكترونات من تأشيب داخل الخلية إلى خارج الخلية للتأكسد ليست محددة تحديداً جيدا. هنا نقدم فحوصات سبيكتروفوتوميتريك من ميوتوبيس C2C12 لرصد استخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية تبميت: تيترازوليوم للذوبان في الماء الملح-1 (WST-1) و 2, 6-ديتشلوروفينوليندوفينول (دبيب أو دسيب). من خلال الحد من هذه متقبلون الإلكترون، نحن قادرون على مراقبة هذه العملية في تحليل في الوقت الحقيقي. مع إضافة الإنزيمات مثل اسكوربات أوكسيديز (AO) وفائق أكسيد الفاءق (الأحمق) إلى فحوصات، يمكننا تحديد أي جزء من تبميت هو سبب إنتاج التصدير أو فائق أكسيد اسكوربات، على التوالي. بينما أبدى WST-1 تحقيق نتائج مستقرة مع خلفية منخفضة، دبيب كانت قادرة على أن تكون إعادة المؤكسد بعد إضافة AO والهيئة العامة للسدود، الذي تجلى بتحليل سبيكتروفوتوميتريك. يوضح هذا الأسلوب مقايسة سبيكتروفوتوميتريك في الوقت الحقيقي، وكذلك متعددة، سريعة مع مزايا أكثر من الأساليب الأخرى المستخدمة لرصد تبميت، مثل سيانيد (فيكن) وتخفيض فيريسيتوتشرومي ج.
المقدمة
قدرة تنقية البلازما الأغشية للحد من المتقبلين للإلكترون أدى إلى ت ري أن غشاء البلازما على قدرات الكامنة الأكسدة1. رأيت سابقا في الفطريات والنباتات، والحيوانات، تبميت عملية مشتركة بين الكائنات الحية متعددة2،3،،من45. على وجه التحديد، هذه العملية قد تجلى في Saccharomyces cerevisiae، الجزرة الخلايا والكريات الحمراء، لمفاوية، osteosarcoma، وسرطان الجلد، الضامة، والهيكل العظمى والعضلات والعدلات2،3، 4 ,
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: انظر الشكل 1 نظرة تخطيطية للخطوات الرئيسية.
1-مقايسة الحد WST-1
- تنمو، والتفريق بين الخلايا C2C12 ملتصقة باستخدام الخلية القياسية الثقافة الإجراءات7 في صفيحة 96-كذلك استخدام الصفوف A-f.
- استخدام وسيلة تمايز تتألف من المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو) وتستكمل مع مصل الحصان 2% و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 0.1 مغ/مل. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- عند رصد مشاركة اسكوربات في تبميت، الملحق وسائط التمايز مع 100 حمض الأسكوربيك ميكرومتر. السماح للخلايا لاحتضان في التمييز بين وسائل الإعلام ل ~ 24-48 h.
<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
إحصاءات أجريت مع ANOVA مع التدابير المتكررة باستخدام البرمجيات الإحصائية RStudio25. يتم الإشارة إلى أحجام العينات في أساطير الرقم.
واستخدمت لرصد تبميت، ميوتوبيس C2C12 جنبا إلى جنب مع الإلكترون خارج الخلية المتقبلين، WST-1 ودبيب. AO واستخدمت لتحديد أي جزء من WST-1 والحد من دبيب يرجع efflux اسكوربات والهيئة العامة للسدود واستخدمت لتحديد أي جزء من الحد WST-1 كان بسبب الإفراج عن فائق أكسيد خارج الخلية. كما هو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد قدمنا طريقتين لاستخدام متقبلون الإلكترون خارج الخلية، WST-1 ودبيب، في فحوصات سبيكتروفوتوميتريك لرصد تبميت في ميوتوبيس C2C12. مع نمو خطوط الخلايا في الإجراءات القياسية الثقافة وقارئ لوحة جهاز المطياف الضوئي، من الممكن رصد تبميت مع هذه متقبلون إلكترون في مقايسة ميكروسكوبية بسيطة. WST-1 الحد استنساخه من بئر إلى داخل فحص، ولكن هناك تقلب يوما بعد يوم. معامل الاختلاف (CV) الاستفادة من برنامج تلفزيوني كالمخزن المؤقت اليومية هو 0.18 والسيرة الذاتية استخدام ميزانيات المخزن المؤقت هو 0.23.
من المؤلف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونود أن أشكر بيل توماس، لين ماتاتهيل ومارك مانينو ونج باتل لتقديم الدعم التقني لهم. وأيد هذا العمل جائزة "الخدمة الصحية العامة في الولايات المتحدة" R15DK102122 من المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي وأمراض الكلي (NIDDK) لجوناثان فيشر. محتوى المخطوطة هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية نيدك أو "المعاهد الوطنية للصحة".
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| C2C12 myoblasts | ثقافة النوع الأمريكي | CRL-1772 | |
| Dulbecco متوسط - منخفض الجلوكوز | Sigma | D6046 | |
| Fetal Plex مركب مصل حيواني | Gemini Bio-Products | 100-602 | |
| بنسلين ستربتومايسين | سيجما | 516106 | |
| مصل الحصان | Gibco Technologies | 16050-130 | |
| Dulbecco's محلول ملحي مخزن فوسفات | Sigma | D8537 | |
| تريبسين-EDTA | Sigma | T4049 | |
| أطباق استزراع 15 سم | TPP | 93150 | |
| 96 ألواح ثقافة الآبار | TPP | 92096 | |
| 2- (4-يودوفينيل) -3- (4-نيتروفينيل) -5- (2،4-ديسولفوفينيل) -2H-تيترازوليوم ملح الصوديوم (WST-1) | Accela ChemBio Inc | SY016315 | |
| فينازين ميثوسلفات | سيجما | P9625 | |
| حمض الأسكوربيك | L-سيجما | A5960 | |
| أسكوربات أوكسيديز | سيجما | A0157 | |
| سوبر أكسيد ديسموتاز | سيجما | S5395 | |
| 2،6-ثنائي كلورو إندوفينول ملح الصوديوم | ICN Biomedicals | 215011825 | |
| D- (+) - الجلوكوز | Sigma | G7528 | |
| HEPES ملح الصوديوم | Sigma | H3784 | |
| كلوريد الصوديوم | Sigma | S7653 | |
| كلوريد البوتاسيوم | Fisher Scientific ؛ | BP366 | |
| كبريتات المغنيسيوم سباعي هيدرات | سيجما | M5921 | |
| كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات | سيجما | C7902 | |
| فوسفات البوتاسيوم | فيشر العلمي | BP363 | |
| بيرس BCA بروتين الفحص كيت | الحرارية العلمية | 23225 | |
| Powerwave X-I مقياس الطيف | Biotek | Insturments توقف | |
| Spectronic Genesys 5 مقياس الطيف | الحراري العلمي | 336001 | |
| صفيحة دقيقة PureGrade 96 جيدا ، F- bottom ، شفافة ، غير معالجة ، غير معقمة | MidSci | 781602 | |
| الحديد (II) كلوريد رباعي الهيدرات | سيجما | 220299 | |
| كبريتات الحديد (II) سباعي الهيدرات | سيجما | 215422 | |
| هيبوكسانثين | سيجما | H9636 | |
| زانثين أوكسيديز | سيجما | X4500 | |
| Excel | مايكروسوفت | ||
| آر ستوديو | Rstudio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/ | |
| KC4 | Biotek | Insturments discontinued discontinued |
المراجع
- Kilberg, M. S., Christensen, H. N. Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell. Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).
- Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. Transmembrane ferricyanide ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
