En protokol til fremstillingen af polymert tyndfilm kompositstrukturer besidder enten forskellige unge moduli eller tykkelser er præsenteret. Film er produceret for avancerede celle kultur studier eller som huden klæbemidler.
I denne protokol præsenterer vi metoder til at fremstille tynde elastomer sammensat film for avancerede celle kultur applikationer og udvikling af hud klæbemidler. To forskellige poly-(dimethyl siloxanes) (PDMS og blød hud lim (SSA)), har været brugt til i dybden med undersøgelsen af biologiske effekter og klæbende egenskaber. De sammensatte film består af en fleksibel støtte lag og en selvklæbende top belægning. Begge lag er blevet fremstillet af læge klinge ansøgning teknik. I den foreliggende undersøgelse, er den klæbende adfærd af de sammensatte film blevet undersøgt som en funktion af lagtykkelse eller en variation af den unge modulus af det øverste lag. De unge modulus af PDMS er blevet ændret af varierende base til crosslinker blandingsforholdet. Derudover tykkelsen af SSA film har været varierede fra ca. 16 µm til ca. 320 µm. Scanning elektronmikroskopi (SEM) og optisk mikroskopi har været anvendt til tykkelsesmålinger. De klæbende egenskaber af elastomer film afhænger kraftigt filmtykkelse, de unge modulus af polymerer og overfladekarakteristika. Derfor er normal vedhæftning af disse film på glas substrater udstiller glat og ru overflader blevet undersøgt. Pull-off stress og arbejde af adskillelse er afhængige af blandingsforholdet af silikone elastomerer.
Derudover har været varieret tykkelsen af den bløde hud selvklæbende placeret på toppen af en støttende opbakning lag for at producere patches til hud applikationer. Cytotoksicitet, spredning og cellulære vedhæftning af L929 murine fibroblaster på PDMS film (blanding forholdet 10:1) og SSA film (blanding forholdet 50: 50) er blevet gennemført. Vi har vist her, for første gang, side om side sammenligning af tynde sammensat film produceret af begge polymerer og fremlægge undersøgelsen af deres biologiske- og klæbende egenskaber.
I denne protokol præsenteres detaljerede metoder til fremstilling af tynd elastomer film. Bredt tilgængelige læge klinge teknik er blevet brugt til fremstilling af tynd sammensat film. Produktion teknik er udført på polyethylenterephtalate (PET) folier, gør det muligt efterfølgende produktion af disse film i stor skala. Vægten af denne protokol er vurderingen af reproducerbarhed, præcis fremstilling af de forskellige lag af de sammensatte film og bestemmelse af de biologiske og vedhæftning egenskaber af den endelige sammensatte patch. Silikoneelastomer poly-(dimethylsiloxane) (PDMS) er flittigt brugt i biomedicinsk teknologi, herunder produktion af huden klæbemidler, mikrofluidik applikationer og yderligere forskning felter1,2,3 ,4. For nylig, en anden underklasse af PDMS, så kaldes blød hud lim (SSAs) har været indført, navnlig for blid hud limning og de-bonding.
Silikone SSAs er vinyl functionalized elastomerer, forskellig fra den analoge polymerer af manglende styrke silica5. Svarende til andre PDMS, SSA Youngs modulus kan tilpasses i en bred vifte af modulerende tværs linker koncentration eller hærdning tid6,7,8. Denne ændring i Youngs modulus af silikone elastomerer påvirker materialets klæbende egenskaber betydeligt og har også dybtgående konsekvenser på prokaryote og eukaryote celler dyrkes på overfladen9,10 , 11. på celleniveau biologisk, det var vist, at eukaryote celler reagerer på signaltransduktion niveau på en graduering af matrix elasticitet eller tykkelse af overflade9,10,12 ,13,14. Derfor en bred interesse i celle kultur anvendelser af polymerer med afstemmelige mekaniske egenskaber findes. Vigtigere, giver den uløseligt lav overflade energi af silikone baseret elastomerer ikke optimale betingelser for cellekultur af eukaryote celler. Ilt plasma behandling er en udbredt teknik til at øge PDMS overflade lavenergi midlertidigt, fører til en forbedring af pull-off styrken, faldt overfladen adsorption af molekyler, mens i parallel fremme vedhæftet fil, spredning og spredning af eukaryote celler15,16,17,18.
Ud over materialer egenskaberne påvirker den overflade topografi væsentligt cellulære vedhæftning og klæbende samspillet mellem to materialer19,20,21,22. Overfladeruhed har flere virkninger på den kontakt dannelse mellem to overflader: reduktion af kontaktområdet, høj gemt elastisk energi omkring asperities samt indflydelse på knæk formering kan ændre klæbestyrke23, 24. Vedhæftning af selvklæbende film til menneskers hud er en spirende programfelt, f.eks. forbindinger, fiksering af EKG-elektroder eller andre bærbare elektroniske enheder25,26,27, 28. For at måle den klæbende ydeevne af self-lim i forhold til overflade topografi, kan glas substrater med varierende grader af ruhed bruges i normale vedhæftning målinger8,21. Her, er to glas substrater blevet udvalgt til at undersøge de klæbende egenskaber af polymer film. Første, sammensat film med en PDMS opbakning lag i blandingsforholdet af 10 til 1 vægt dele omfattet af PDMS med forskellige blandingsforholdet blev præget. I et andet trin fremstillet en SSA klæbelag med lige vægt mængder af begge komponenter og med varierende filmtykkelse på toppen af en understøttende PDMS film.
Design af kompositstrukturer giver den enkel justering af materialeegenskaber, som Young’s modulus eller tykkelsen af prøverne. De unge modulus af PDMS kan ændres effektivt i en bred vifte af enten at ændre blandingsforholdet mellem de to komponenter eller fremstilling af blandinger ved hjælp af en anden silikoneelastomer30,31. De beskrevne metoder er ikke begrænset til PDMS bruges i den aktuelle undersøgelse, men især den klæbende ydeevne afhænger stærkt af den specifikke type anvendes. Et kritisk trin i denne protokol er under fremstillingen af de sammensatte film (figur 1). Det var vist, at tykkelsen af filmene påvirker betydeligt vedhæftning adfærd af film på forskellige underlag, herunder hud (figur 5 og figur 6). Ud over filmtykkelse påvirker tid og temperatur under hærdning proces materialeegenskaber32. Parametre som tykkelsen af de polymere lag skal derfor nøje tilpasses og verificeret.
Analyse af de klæbende egenskaber af de tynde film blev udført med normal kraft vedhæftning målinger ved hjælp af to glas substrater med forskellige overfladeruhed op til Ra = 0.338 µm (figur 3). I almindelighed, påvirkninger ruhed betydeligt vedhæftning af overflader, især af elastiske materialer33,34. Ruhed af glas kan varieres let ved slibning med sandpapir i forskellig asperity størrelser, derfor giver mulighed for fremstilling af substrater udstiller højere ruhed værdier21. Derudover kan andre materialer, kan for eksempel epoxyharpiks bruges til fremstilling af substrater15,35. Dette kan være en vigtig ændring strategi præsenteres protokollen. For eksempel, hvis substrater udstiller forskellige overflade frie energier er nødvendige eller specifikke er topografi påkrævet. Her, blev pull-off stress og arbejde for adskillelse af de tynde film produceret af PDMS og SSA analyseret med en skræddersyet setup (makroskopisk vedhæftning måling enhed (MAD, figur 4)). 36 optisk tilpasningen af substrat og indenter er et afgørende skridt til analyse af måleresultaterne. Justering af tilt vinkel skal derfor udføres med goniometer, så præcist som muligt. Dette kan opnås med tilstrækkelig præcision ved manuelt at bringe substrat i kontakt med film overfladen, indtil en horisontal kontakt er opnået.
I den nuværende protokol blev hold tid holdt konstant på ét sekund (figur 5 og figur 7). Især til undersøgelse af den klæbende præstation af en elastisk folie til en ru substrat overflade giver en udvidelse af hold tid yderligere oplysninger. For eksempel, har en stigning i pull-off stress med stigende hold tid været rapporteret8. Ud over målinger foretaget i den nuværende protokol, andre metoder, kunne for eksempel skræl tests udføres, giver mulighed for en mere omfattende undersøgelse af adhæsion ydeevne37.
De klæbende egenskaber af sammensat film udstiller forskellige film tykkelser af blød hud limen blev fastlagt (figur 7). Vores resultater er i overensstemmelse med offentliggjorte data, viser, at en nedgang af filmen tykkelse fører til en stigning på pull-off stress som indespærring, dvs, forholdet mellem substrat diameter og film tykkelse, øger38,39 . Baseret på disse resultater og de data, der er afbildet i figur 7, må vi konkludere at sammensatte film med en samlet tykkelse på ca. 100 µm (tykkelse af SSA lag af ca. 60 µm påføres en PDMS film med en tykkelse på ca. 40 µm) udviser gunstige vedhæftning Pedersen egenskaber for på ru overflader.
Næste, eksperimenter relateret til biologiske karakterisering er blevet udført på uberørte sammensat film og plasma behandlet sammensat film (figur 8). Plasma behandling af silicium elastomerer er en ofte anvendt, alsidige teknik til at øge de hydrofile egenskaber af overflader og fremme cellulære vedhæftet fil og cellulære spredning40,41. Silikone er kendt for deres lav toksicitet og høj biostability men kan indeholde resterende monomerer eller katalysatorer, som kan påvirke fysiologiske processer, fører også til cytotoksicitet42,43. I den gennemførte forsøg vi har observeret mindre end 5% cytotoksicitet ved hjælp af LDH udgivelse som en indikator og en Trypan blå udstødelse assay. I præsenteret protokollen, hele cellulære befolkning, herunder cellulære aggregater løsrevet form overfladen er blevet analyseret for spredning analyse (figur 9B). En ændring af protokollen kunne producere mere differentieret resultater. For hver prøve, kunne supernatanten indeholdende fritliggende cellulære aggregater overføres til en separat reaktion tube og ikke kombineret med cellerne enzymatisk fjernet fra polymer overflade. Dette ville give den nøjagtige vurdering af celler knyttet til overfladen og i sidste ende afslører en nærmere bestemmelse af polymerer indflydelse på processen, cellulære vedhæftning. Ud over de andre metoder, der præsenteres her, kan celler høstes til undersøgelsen med immunblot metoder, giver en detaljeret kvantitativ vurdering af protein udtryk.
I Resumé, har vi etableret produktionsvilkår for tynde elastomere sammensatte filmproduktion til applikationer i avancerede celle kultur forskning. Derudover besidder disse tynde film høj tilpasningsevne huden ruhed, gør det muligt for avancerede design af huden klæbemidler.
The authors have nothing to disclose.
Martin Danner er anerkendt for sin bistand til forberedelse af prøver og etablering af celle kultur procedurer. Forfatterne vil gerne takke Biesterfeld Spezialchemie GmbH (Hamburg, Tyskland), især Robert Radsziwill for løbende support og diskussioner. Forskning fører til disse resultater har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd under EUs syvende rammeprogram (FP/2007-2013) ERC tilskudsaftalen n. 340929.
2-Propanol, 97% | Stockmeier Chemie | 1000452610000 | Isopropanol |
Abrasive diamnod hand pad | Bohle | MO 5007522 | Grit: 220 |
Accutase | Capricorn Scientific | ACC-1B | |
Albumin Fraktion V | Roth | 0163.2 | BSA |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | ThermoFischer Scientific | A12379 | highly toxic |
Aquamount | Polysciences | 18606-20 | water soluble mounting medium |
CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay | Promega | G7890 | |
DPBS, without Ca2+, Mg2+ | ThermoFischer Scientific | 14190094 | |
Fetal bovine serum gold | GE Health Care Life Science | A15-151 | FBS |
Goniometer OCA35 | Dataphysics | for the determination of the static water contact angle | |
Hoechst Dye 33342 | Sigma-Aldrich | B1155-100MG | bisBenzimide H 33342 trihydrochloride, highly toxic |
Microscope Axiovert 25 | Zeiss | Microscope used for cell culture documentation | |
Microscope Eclipse LV100ND | Nikon | Microscope used for film thickness determination | |
Paraformaldehyde, aqueous solution 16% | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | electron microscopy grade |
penicillin und streptomycin solution | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
Phenom XL Scanning Electron Microscope (SEM) | Phenom | ||
Poly-(vinyl alcohol) 4-88, MW 31000 | Sigma-Aldrich | 81381-1KG | Mowiol 4-88 |
Poly-dimethyl siloxanes, Sylgard 184 | Dow Corning | (400)000108351397 | PDMS |
RPMI 1640 basal medium | ThermoFischer Scientific | 21875034 | |
soft skin adhesive (SSA) | Dow Corning | (400)000108251792 | MG 7-9800 Soft Skin Adhesive (SSA) |
speed mixer DAC 600.2 VAC-P | Hauschild | ||
stylus profilomter | Zeiss | Model: SURFCOM 1500SD3 | |
Tecan Infinite M200 pro | Tecan | fluorescence plate reader | |
Triton X 100 | Calbiochem | 648466 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | highly toxic |
Trypsin/EDTA solution | PAN-Biotech | P10-023500 | 0.05% Trypsin, 0.02% EDTA in PBS |
UV glue | Bohle | BO MV76002 | medium viscosity |