Här presenterar vi och kontrast två protokoll används för att decellularize växt vävnader: en diskmedel-baserade strategi och en tvättmedel-gratis strategi. Båda metoderna lämna bakom den extracellular matrisen av växt vävnader används, som sedan kan utnyttjas som ställningar för tissue engineering program.
Autolog, syntetiska och animaliska grafterna för närvarande används som ställningar för vävnad ersättare har begränsningar på grund av låg tillgänglighet, dålig biokompatibilitet och kostnad. Växt vävnader har goda egenskaper som gör dem unikt lämpad för använda som ställningar, såsom höga yta, utmärkt vattentransport och lagring, sammankopplade porositet, konstaterad vaskulär nätverk och ett brett utbud av mekaniska egenskaper. Två framgångsrika metoder för växt decellularization för tissue engineering program beskrivs här. Den första metoden bygger på tvättmedel bad för att ta bort cellulära material, som liknar tidigare etablerade metoder användas för att rensa däggdjur vävnader. Andra är en tvättmedel-fri metod anpassad från ett protokoll som isolerar leaf vaskulatur och innebär användning av en uppvärmd blekmedel och salt bad att rensa blad och stjälkar. Båda metoder ge ställningar med jämförbara mekaniska egenskaper och låg cellulära metaboliska effekt, vilket möjliggör för användaren att välja det protokollet som bättre passar deras avsedda tillämpning.
Vävnadsteknik dök upp på 1980-talet att skapa levande vävnad substitut, och potentiellt adress betydande organ och vävnad brist1. En strategi har använt ställningar för att stimulera och vägleda kroppen att regenerera saknas vävnader eller organ. Även om avancerad tillverkning metoder såsom 3D-utskrift har producerat ställningar med unika fysiska egenskaper, förblir förmågan att tillverka ställningar med ett varierat utbud av uppnåeliga fysiska och biologiska egenskaper en utmaning2 , 3. Dessutom på grund av en funktionell vaskulär nätverk, dessa tekniker har begränsats i regenererande 3-dimensionell vävnader. Användning av cell-lösa djur och mänskliga vävnader som ställningar har hjälpt kringgå detta problem4,5,6,7. Men höga kostnader, sats till sats variabilitet och begränsad tillgänglighet kan begränsa utbredd användning av cell-lösa djur ställningar8. Det finns också farhågor om potentiella sjukdomsspridning till patienter och immunologisk reaktion mot vissa cell-lösa däggdjur vävnader9.
Cellulosa, härrör från växt- och bakteriella källor, har använts i stor utsträckning att generera biomaterial för ett brett användningsområde inom regenerativ medicin. Några exempel är: Ben10,11, brosk12,13,14 och15för sårläkning. Ställningar som består av cellulosa har en fördel i att de är hållbara och motståndskraftiga mot att brytas ner av däggdjursceller. Detta är på grund av att däggdjursceller inte producerar enzymerna som är nödvändiga för att bryta ner cellulosa molekyler. I jämförelse, ställningar produceras med hjälp av makromolekyler från den extracellulära matrixen, såsom kollagen, bryts lätt ned16 och kanske inte passar till långsiktiga program. Kollagen ställningar kan stabiliseras av kemiska cross-linking. Det finns dock en avvägning på grund av den inneboende toxiciteten för de cross-linkers som påverkar biokompatibiliteten av ställningar17. Omvänt, cellulosa har potential att vara närvarande vid implanteringsstället för längre perioder eftersom det är okänsligt mot enzymatisk nedbrytning av däggdjursceller18,19,20. Detta kan ändras genom att trimma nedbrytningshastighet genom hydrolys förbehandling och samtidig leverans av ställningar med cellulases21. Biokompatibiliteten av cell-lösa vegetabiliska cellulosa ställningar i vivo har också påvisats i en studie på möss22.
Genom hundratals miljoner år av evolution, har växter förfinat sin struktur och sammansättning för att öka effektiviteten i vätsketransport och lagring. Anläggningen vaskulär fartyg minimera hydrauliska motstånd genom förgrening till mindre fartyg, liknar den hos däggdjur vaskulatur enligt Murrays lag23. Efter decellularization bibehålls växtens komplext nätverk av fartyg och sammankopplade porer. Med tanke på det stora antalet olika växtarter som är lättillgänglig har vegetabiliska ställningar potential att övervinna designbegränsningar som för närvarande påverkar ställningar i tissue engineering24,25. Exempelvis visat Modulevsky et al. att angiogenes och cell migration inträffade när cell-lösa apple vävnad var implanteras subkutant på baksidan av en mus22. Likaså visade Gershlak et al. att endotelceller kunde odlas inom vaskulatur cell-lösa blad24. I en separat experiment kunde Gershlak et al. också visa att hjärtmuskelcellerna kan odlas på ytan av blad och skulle kunna ingå avtal24.
Växter även komplexa organisationen från cellnivå till makroskopiska skalan, vilket är svårt att uppnå även med de mest avancerade tillverkningstekniker som utvecklat hittills. Den komplexa hierarkiska utformningen av växt vävnader gör dem starkare än summan av deras beståndsdelar26. Växter har en uppsjö av olika mekaniska egenskaper alltifrån styv och tuff komponenter såsom stjälkar, till mycket mer flexibel och smidig kära som lämnar27. Bladen varierar beroende på Art storleksmässigt, forma, bryta styrka, graden av vaskularisering, och kan bära olika grader av hydrophilicitet. Sammantaget tyder dessa växt-egenskaper på att cell-lösa växter kan tjäna som unika och mycket funktionell medicintekniska produkter, inklusive som Vävnadsrekonstruktion ställningar.
Detta protokoll fokuserar på två metoder att decellularize växt vävnader, såsom blad och stjälkar, för användning som ställningar i vävnadsteknik. Den första metoden är ett diskmedel-baserade teknik som använder en rad bad att ta bort DNA och cellulära materia, som har anpassats från en allmänt använd teknik decellularize däggdjur och plantera vävnader6,22,25 ,28,29,30. Den andra metoden är fritt från rengöringsmedel och är anpassade från en ”skeletonization”-protokollet används ofta för att ta bort de mjuka vävnaderna i blad31. Tidigare arbete visade att puttra bladen i en blekmedel och natriumbikarbonat lösning underlättat separation av kärlsystemet från omgivande mjukvävnad31. Denna teknik kan hänvisas tillbaka till experiment som utförts i den 17: e och 18: e århundraden, såsom Albertus Seba32 och Edward Parrish33arbete. Dessa experiment centrerad kring lämnar växtmaterial, som löv och frukt, nedsänkt i vatten under längre tid (veckor till månader) och att låta mjukare vävnader att förfalla bort naturligt. Här är metoden ”skeletonization” anpassad för att använda mildare villkor, såsom längre inkubationstider vid lägre temperaturer, att ta bort cellulära rester och undvika påtagligt störa mjuk vävnad struktur. För de experiment som beskrivs häri, tre växttyper användes: Ficus hispida, Pachira aquatica och en art av Garcinia. Resultaten av DNA kvantifiering, mekaniska tester och inverkan på cellulära metaboliska aktiviteten från båda metoderna beskrivs.
Häri, beskrivs två metoder för att decellularize växt vävnader. Resultaten presenteras här, tillsammans med resultaten av tidigare studier25, tyder på att protokollen uträcka sannolikt gäller för ett brett spektrum av växtarter och kan utföras på både stjälkar och blad. Dessa förfaranden är enkel och kräver inte specialutrustning, så växten decellularization kan utföras i de flesta laboratorier. Det är anmärkningsvärt att ställningar måste vara functionalized efter decell…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka John Wirth av Olbrichs trädgårdarna för nådigt levererar de prover som används i detta projekt. Detta arbete stöds delvis av den nationella hjärta, lunga och Blood Institute (R01HL115282 till G.R.G.) National Science Foundation (DGE1144804 till J.R.G och G.R.G.), och University of Wisconsin Institutionen för kirurgi och Alumni fond (H.D.L.). Detta arbete var också stöds delvis av Naturvårdsverket (STAR grant nr 83573701), National Institutes of Health (R01HL093282-01A1 och UH3TR000506) och National Science Foundation (IGERT DGE1144804).
Sodium dodecyl sulfate | Sigma Life Science | 75746-1KG | |
Triton X-100 | MP Biomedicals, LLC | 807426 | Non-ionic surfactant referenced in paper. Very viscous reagent, can help to cut end of pipette tip when drawing it up. |
Concentrated bleach (8.25% sodium hypochlorite) | Clorox | Item #: 31009 | Standard concentrated bleach. |
Sodium bicarbonate | Acros Organics | 217120010 | Can be substituted with sodium hydroxide or sodium carbonate. |
8 mm Biopunch | HealthLink | 15111-80 | Cuts samples that fit well in 24 well plate |
Belly Dancer-Shake table | Stovall Life Sciences | BDRAA115S | Use low speeds to not damage tissues. Can use any model/brand of shake table. |
Isotemp hot/stir plate | Fisher Scientific | Can use any style/brand of hot/stir plate. | |
Beaker | Any | Can use any size beaker as long as it will fit your samples and not overcrowd them. | |
Tris Hydrochloride | Fisher Scientific | BP153-500 | |
DMEM | Corning | MT50003PC | |
Quant-iT Picogreen dsDNA assay | Life Technologies | P11496 | Can use any dsDNA quantification mehtod on hand. |