Questo manoscritto descrive un protocollo per studiare l'effetto antimicrobico della terapia fotodinamica mediata da acido 5-aminolevulinico (ALA-PDT) su un biofilm di Staphylococcus aureus . Questo protocollo può essere usato per sviluppare un modello in vitro per studiare il trattamento di biofilm batterici con PDT in futuro.
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Articolo metodologico
Un modello In Vitro per studiare l'effetto della terapia fotodinamica 5-aminolevulinico-mediata su Staphylococcus aureus Biofilm
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) è un agente patogeno umano comune, che provoca infezioni pyogenic e sistemiche. Le infezioni da S. aureus sono difficili da sradicare non solo causa la comparsa di ceppi resistenti agli antibiotici, ma anche la capacità di forma biofilm. Recentemente, la terapia fotodinamica (PDT) è stata indicata come uno dei potenziali trattamenti per controllare le infezioni biofilm. Tuttavia, ulteriori studi sono richiesti per migliorare la nostra conoscenza del suo effetto sul biofilm batterici, come pure i meccanismi di fondo. Questo manoscritto descrive un modello in vitro di PDT con acido 5-aminolevulinico (5-ALA), un precursore del fotosensibilizzatore effettivo, la protoporfirina IX (PpIX). Maturo, brevemente, lo Staphylococcus aureus biofilm sono stati incubati con ALA e quindi esposti alla luce. Successivamente, l'effetto antibatterico di ALA-PDT il biofilm di S. aureus è stato quantificato calcolando l'unità (CFUs) di formazione di colonie e visualizzata da vitalità fluorescente colorazione tramite laser confocale microscopia (CLSM). Risultati rappresentativi hanno dimostrato un forte effetto antibatterico di ALA-PDT il biofilm di S. aureus . Questo protocollo è semplice e può essere utilizzato per sviluppare un modello in vitro per studiare il trattamento di biofilm di S. aureus con ALA-PDT. In futuro, potrebbe anche fare riferimento a studi di PDT che utilizzano altri fotosensibilizzanti per differenti ceppi batterici con minimo aggiustamento.
Introduzione
S. aureus è un importante patogeno gram-positivo che colonizza la pelle e delle mucose degli umani. Sua capacità di forma biofilm è considerato un aspetto importante della sua patogenesi1. Biofilm batterici sono una comunità di batteri incorporati in una matrice autoprodotta, che è composto di sostanze polimeriche extracellulari, inclusi polisaccaride, DNA e proteine. Questa matrice gioca un ruolo significativo nella persistenza di infezioni batteriche, che contribuiscono ad un alto grado di resistenza per il sistema immunitario umano e attuale terapie anti-microbica2. Gli antibiotici sono ancora il principale t....
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Protocollo
1. di biofilm
-
Formazione di biofilm a 96 pozzetti
- Recuperare il ceppo di Staphylococcus aureus USA300 e 3 che formano biofilm ceppi clinici (C1 - C3) conservati a-80 ° C.
Nota: La capacità dei ceppi clinici per formare biofilm è stato determinato mediante l'analisi del piatto di microtitolo descritta precedentemente15. - Inoculare il batterio nel mezzo di 5ml tryptone soya brodo (TSB) e coltivare in un incubatore con agitazione a 37 ° C durante la notte per la fase stazionaria.
- Centrifugare la coltura batterica durante la notte a 4.000 x g per 10 min a 25 ° C e quindi scartar....
- Recuperare il ceppo di Staphylococcus aureus USA300 e 3 che formano biofilm ceppi clinici (C1 - C3) conservati a-80 ° C.
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Risultati
La vitalità dei batteri nel biofilm è stata diminuita dopo il trattamento ALA-PDT rispetto ai controlli (ALA - ALA + LED, LED-- e ALA-LED +) sia in USA300 che i tre ceppi clinici (Figura 1).
Per confermare i risultati dal CFU di analisi e osservano l'antibatterico effetto del ALA-PDT lo S. aureus biofilm in situ, il biofilm di USA300 sono state visualizzate da CLSM con vitalità col.......
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Discussione
PDT è stata una terapia ben studiata per il trattamento del cancro, quando è stato inventato più di 100 anni fa18. Nell'ultimo decennio, è stata applicata come una strategia antimicrobica e ha indicato l'efficacia contro alcuni batteri patogeni resistenti agli antibiotici12PDT. Rispetto allo stato planctonico, biofilm batterici sembrano essere più resistenti al trattamento antibiotico3, mentre l'effetto di ALA-PDT il biofilm non è stato completamente.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale di scienza natura della Cina per giovani studiosi (No. 81300810), programma di formazione di Shanghai il giovane dottore (No. 20141057) e National Natural Science Foundation of China (81671982, 81271791 e 81571955). Vorremmo ringraziare LetPub (www.letpub.com) per fornire assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Triptone Brodo di Soia (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Triptone Agar di Soia (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Kit di vitalità batterica |
| Ioduro di propidio (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | I kit di vitalità batterica LIVE/DEAD BacLight |
| Pancreatina | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| acido 5-aminolevulinico (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus ceppo USA300 | / | / | La fonte dei riferimenti USA 300 " Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. settembre 2009; 64(3):441-6". |
| Staphylococcus aureus ceppi clinici (C1-C3) | / | / | Tutti i ceppi clinici sono stati isolati da pazienti con rinosinusite cronica nel Dipartimento di Otorinolaringoiatria-Chirurgia della testa e del collo, Ospedale oculistico e otorinolaringoiatrico dell'Università di Fudan [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| Micropiastra a 96 pozzetti | Corning Inc | 3599 | Micropiastre trasparenti in polistirene a fondo piatto trattate con TC, confezionate singolarmente, con coperchio, |
| Piastra fluorescente | NEST Biotechnology | 801001 | Fondo in vetro, Provette Eppendorf Safe-Lock non pirogene |
| , 1,5 mL | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5417 | Eppendorf | Z365998 | Incubatore SIGMA | |
| Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Agitatori orbitali da banco | |
| Diodo a emissione di luce (LED) | Wuhan Yage Tecnica ottica ed elettronica CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 Microscopio a scansione laser confocale | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS Software AF | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
Riferimenti
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A.
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Ristampe e permessi
