Ultralow inngang genomet sekvensering biblioteket forberedelse fra en enkelt Tardigrade prøven
Summary
Forurensing under den genomisk sekvensering av mikroskopiske organismer er fortsatt et stort problem. Her viser vi en metode for å sekvens genomet av en Bjørnedyr fra en enkelt prøve med 50 pg genomisk DNA uten hele genomet forsterkning å minimere risikoen for forurensning.
Abstract
Tardigrades er mikroskopiske dyr som angir en ametabolic tilstand kalt anhydrobiosis når uttørking og kan gå tilbake til sin opprinnelige tilstand når vannet er angitt. Den genomisk sekvensering av mikroskopiske dyr som tardigrades risiko bakteriell forurensning som noen ganger fører til fremtiden, for eksempel om omfanget av horisontal genoverføring i disse dyrene. Her gir vi en ultralow inndatametode til å sekvens genomet av Bjørnedyr, Hypsibius dujardini, fra et enkelt eksemplar. Ved å bruke strenge vask og miljøgifter utelukkelse sammen med en effektiv utvinning av 50 ~ 200 pg genomisk DNA fra en enkeltperson, vi bygget et bibliotek sekvensielt med en DNA sekvensering instrument. Disse bibliotekene var svært reproduserbare og upartisk, og en informatikk analyse i sekvensert lyder med andre H. dujardini genomer viste en minimal mengde forurensning. Denne metoden kan brukes til unculturable tardigrades som ikke kan være sekvensielt ved hjelp av metodene.
Introduction
Tardigrades er mikroskopiske dyr som kan angi en ametabolic tilstand som kalles anhydrobiosis når mot uttørking. De gjenopprette absorpsjon av vann1,2. Ametabolic staten er tardigrades i stand til å tolerere ulike ekstreme miljøer, som inkluderer ekstreme temperaturer3 og press4,5, en høy dose av ultrafiolett lys6, røntgenstråler og gammastråling 7 , 8og kosmiske rom9. Genomic data er en uunnværlig for å studere molekylære mekanismer av anhydrobiosis.
Tidligere forsøk på å sekvens genomet av tardigrades har vist tegn på bakteriell forurensning10,11,12,13,14. Genomic sekvensering fra slike små organismer krever et stort antall dyr og er liggende å bakteriell forurensning; Derfor har vi tidligere etablert en sekvensering protokollen bruker en ultralow inndatametode fra en enkelt eksemplar av Bjørnedyr, for å minimere risikoen for forurensing15. Bruker disse dataene, har vi ytterligere gjennomført en høy kvalitet resequencing og gjenoppbygging av genomet av H. dujardini16,17. Her vi beskrive i detalj denne metoden for genomisk sekvensering fra en tardigrade enkeltperson ()figur 1). Validering av denne sekvensering metoden er utover fokuset i dette papiret og har allerede vært utredet grundig i vår forrige rapport16.
Denne metoden består av to deler: isolering av en enkelt Bjørnedyr med lavest mulig forurensing og høy kvalitet utvinning av piktogram DNA. Bjørnedyr er utsultet skylles grundig med vann, samt antibiotika og observerte under et mikroskop med 500 X forstørrelse å sikre fjerning av alle bakteriell forurensning. Tidligere estimater og målinger viser at en enkeltperson av Bjørnedyr inneholder ca 50-200 pg genomisk DNA16, som er utvunnet av cracking chitin ytre skjelett av fryse-Tin sykluser eller manuell homogenisering. Denne genomisk DNA er sendt til biblioteket konstruksjon og rekkefølge på en DNA sekvensering instrument. En ekstra informatikk analyse viser høy kvalitet sekvensering, i tillegg til lave nivåer av forurensning i forhold til tidligere tardigrade sekvensering prosjekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bakteriell forurensning utgjør en trussel mot den genomisk sekvensering av mikroskopiske organismer. Mens tidligere studier på tardigrade genomet sekvensering har filtrert ut forurensning med omfattende informatikk metoder12,20, sekvensielt vi genomet fra en enkeltperson å minimere risikoen for forurensing. Siden en personlige Bjørnedyr inneholder ca 50-200 pg genomisk DNA16 og innkapslet i et tykt lag av chitin exoskeleton, utelukkels…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Nozomi Abe, Yuki Takai og Nahoko Ishii deres teknisk støtte i genomisk sekvensering. Dette arbeidet ble støttet av Grant-in-Aid for Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) stipendiat, KAKENHI Grant-in-Aid for unge forskere (No.22681029) og KAKENHI Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (B), No. 17 H 03620 fra JSP, ved en Stipend for grunnleggende vitenskap prosjekter fra The Sumitomo Foundation (No.140340), og dels av forskningsmidler fra Yamagata prefekturs regjeringen og Tsuruoka City, Japan. Chlorella vulgaris brukt til å mate tardigrades ble levert fra Chlorella Industry Co Ltd
Materials
| SZ61 microscope | OLYMPUS | ||
| BactoAgar | Difco Laboratories | 214010 | |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco by life technologies | 15140-148 | |
| VHX-5000 System | Keyence | ||
| 0.2mL Silicone coating tube | Bio Medical Science | BC-bmb20200 | |
| Quick-DNA Microprep Kit | ZYMO Research | D3021 | Use of this kit is absolutey critical; see step 3.1 |
| 1.5 mL microtube | greiner bio-one | 616-201 | See 4.1.1 |
| HIgh speed refrigerated micro centrifuge | TOMY | MX-307 | |
| Covaris M220 | Covaris Inc. | 4482277 | |
| ThruPLEX DNA-Seq kit | Rubicon Genomics | CAT. NO. R400406 | Use of this kit is absolutey critical; see step 4.2 |
| Thermal Cycler | Bioer Technology | TC-96GHbC | |
| AMPure XP reagent | BECKMAN COULTER Life Science | A63881 | |
| Ethanol | Wako | 054-027335 | |
| EB buffer | QIAGEN | 19086 | |
| 2200 TapeStation | Agilent | G2965AA | |
| D1000 Reagents | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Qubit dsDNA BR Buffer/Reagent | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
| Cubee Mini-Centrifuge | RecenttecGenereach | R5-AQBD01aqbd | |
| MiSeq 600 cycle v3 | Illumina Inc. | MS-102-3003 | |
| MiSeq Sequencer | Illumina Inc. | SY-410-1003 |
References
- Crowe, J. H., Hoekstra, F. A., Crowe, L. M. Anhydrobiosis. Annual Review of Physiology. 54 (1), 579-599 (1992).
- Mobjerg, N., et al. Survival in extreme environments – on the current knowledge of adaptations in tardigrades. Acta Physiologica. 202 (3), 409-420 (2011).
- Becquerel, P. La suspension de la vieau dessous de 1/20 K absolu par demagnetization adiabatique de L’alun de fer dans le vide les plus eléve. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences. 231, 261-264 (1950).
- Ono, F., et al. Effect of ultra-high pressure on small animals, tardigrades and Artemia. Cogent Physics. 3 (1), 1167575 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Tolerance of anhydrobiotic eggs of the Tardigrade Ramazzottius varieornatus to extreme environments. Astrobiology. 12 (4), 283-289 (2012).
- Horikawa, D. D., et al. Analysis of DNA repair and protection in the Tardigrade Ramazzottius varieornatus and Hypsibius dujardini after exposure to UVC radiation. PLoS One. 8 (6), e64793 (2013).
- Horikawa, D. D., et al. Radiation tolerance in the tardigrade Milnesium tardigradum. International Journal of Radiation Biology. 82 (12), 843-848 (2006).
- May, R. M., Maria, M., Gumard, J. Action différentielle des rayons x et ultraviolets sur le tardigrade Macrobiotus areolatus, a L’état actif et desséché. Bulletin Biologique de la France et de la Belgique. 98, 349-367 (1964).
- Jonsson, K. I., Harms-Ringdahl, M., Torudd, J. Radiation tolerance in the eutardigrade Richtersius coronifer. International Journal of Radiation Biology. 81 (9), 649-656 (2005).
- Bemm, F., Weiss, C. L., Schultz, J., Forster, F. Genome of a tardigrade: Horizontal gene transfer or bacterial contamination?. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3054-E3056 (2016).
- Delmont, T. O., Eren, A. M. Identifying contamination with advanced visualization and analysis practices: metagenomic approaches for eukaryotic genome assemblies. PeerJ. 4, e1839 (2016).
- Koutsovoulos, G., et al. No evidence for extensive horizontal gene transfer in the genome of the tardigrade Hypsibius dujardini. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (18), 5053-5058 (2016).
- Boothby, T. C., Goldstein, B., et al. Reply to Bemm et al. and Arakawa: Identifying foreign genes in independent Hypsibius dujardini genome assemblies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3058-E3061 (2016).
- Boothby, T. C., et al. Evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (52), 15976-15981 (2015).
- Arakawa, K. No evidence for extensive horizontal gene transfer from the draft genome of a tardigrade. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (22), E3057 (2016).
- Arakawa, K., Yoshida, Y., Tomita, M. Genome sequencing of a single tardigrade Hypsibius dujardini individual. Scientific Data. 3, 160063 (2016).
- Yoshida, Y., et al. Comparative genomics of the tardigrades Hypsibius dujardini and Ramazzottius varieornatus. PLoS Biology. 15 (7), e2002266 (2017).
- He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio101, e47 (2011).
- Andrews, S. . FastQC a quality-control tool for high-throughput sequence data. , (2015).
- Hashimoto, T., et al. Extremotolerant tardigrade genome and improved radiotolerance of human cultured cells by tardigrade-unique protein. Nature Communications. 7, 12808 (2016).
- Zimin, A. V., et al. The MaSuRCA genome assembler. Bioinformatics. 29 (21), 2669-2677 (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Okonechnikov, K., Conesa, A., Garcia-Alcalde, F. Qualimap 2: advanced multi-sample quality control for high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 32 (2), 292-294 (2016).
- Horikawa, D. D., et al. Establishment of a rearing system of the extremotolerant tardigrade Ramazzottius varieornatus: a new model animal for astrobiology. Astrobiology. 8 (3), 549-556 (2008).
