Organotypic kultur metode til at studere udviklingen af embryonale kylling væv
Summary
Her præsenterer vi en organotypic dyrkning protokol for at dyrke embryonale kylling organer in vitro-. Brug denne metode, kan udvikling af embryonale kylling væv studeres, samtidig opretholde en høj grad af kontrol over kultur-miljø.
Abstract
Den embryonale kylling er almindeligt anvendt som en pålidelig model organisme for hvirveldyr udvikling. Dens tilgængelighed og korte inkubation gør periode den ideel til eksperimenter. I øjeblikket, er undersøgelse af disse udviklingsmæssige veje i kylling embryo udført ved at anvende hæmmere og narkotika på lokaliserede sites og ved lave koncentrationer ved hjælp af en række forskellige metoder. In vitro dyrkning af væv er en teknik, der giver mulighed for undersøgelse af væv adskilt fra værtsorganisme, mens samtidig omgåelse mange af de fysiske begrænsninger findes, når du arbejder med hele embryoner, såsom modtagelighed af embryoner til høje doser af potentielt dødbringende kemikalier. Vi præsenterer her, en organotypic dyrkning protokol for dyrkning af de embryonale kylling halvt hoved i vitro, som præsenterer nye muligheder for undersøgelse af udviklingsmæssige processer ud over de i øjeblikket etablerede metoder.
Introduction
Den embryonale kylling (Gallus gallus) er en fremragende model organisme almindeligt anvendt inden for biologi. Dens Inkubationstiden er ca 21 dage og mange æg kan være udruget samtidigt, hvilket gør eksperimenter, hurtig og effektiv. Måske vigtigst, fosteret er også nemt at manipulere, aktivering af den omfattende undersøgelse af vigtige udviklingsprocesser og gener og proteiner, der styrer disse processer.
Embryonale kylling øjet er et komplekst organ, der udvikler sig via et samspil mellem en række forskellige væv magen til mange andre body systems. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af udviklingen af disse væv, især i fremskredne stadier af udvikling. For eksempel, kan multi-lag nethinden være af særlig interesse for dem, der studerer udviklingen af nervesystemet. Alternative metoder, der aktiverer undersøgelse af andre øjet væv som hornhinden, vitreal krop, linsen, sclera og øjenlåg er til gavn for forskere. Kylling embryonale øjet indeholder også en række flade knogler, de scleral øreknoglerne, som kan bruges som model for studiet af intramembranous knogle induktion og ossifikation i hvirveldyr1.
I øjeblikket, er der en række metoder, der anvendes til at studere embryonale udvikling. Microinjections hæmmende antistoffer eller andre hæmmende molekyler2,3, implanteret kirurgisk microbeads gennemblødt i inhibitor4, og elektroporation5 er alle metoder, der kan bruges til at nedregulere gener eller proteiner af interesse i et foster. Lignende metoder bruges til at upregulate proteiner. Disse metoder er ikke uden deres begrænsninger. For eksempel, når du bruger kemikalier til at ændre den embryonale udvikling, de dødelige virkninger på fosteret skal evalueres, og dette begrænser brugen af de ovennævnte metoder til lokaliserede sites anvendelse ved doser lav nok til at sikre overlevelsesevne den embryo.
In vitro dyrkning af væv er blevet brugt i en lang række organismer for at studere udvikling og kan bruges til at omgå nogle af de ovennævnte begrænsninger. For eksempel, er den femora6og fjer knopper7,8, lemmer9 af kylling alle blevet studeret ved hjælp af væv dyrkning metoder, som har testiklerne af musen10 og rødder og stængler af planter11. Disse metoder giver forskerne en høj grad af kontrol over væv udvikling, såsom evnen til at svinge temperaturen og ændre den næringsstoftilgængelighed. Isolering af væv fra hele fosteret gør det også langt mindre modtagelige for de dødelige virkninger af kemikalier, således at manipulation undersøgelser på globalt plan ved højere koncentrationer. En anden bemærkelsesværdig fordel i vitro dyrkning er bevarelsen af det væv cellulære miljø; arrangement af væv forbliver relativt uændret, hvilket gør det muligt at studere samspillet mellem forskellige væv typer9. Således metoder i vitro dyrkning åbner døre til yderligere eksperimentelle ikke til rådighed i vivo eller ovo modeller.
I øjeblikket er studerer udviklingen af embryonale kylling øjet ved hjælp af kemikalier særligt udfordrende. En række af extraembryonic membraner dækker embryo, hvilket gør det vanskeligt at anvende microbeads eller kemikalier; fosteret er også meget aktive inden for æg, som det bliver ældre, yderligere komplicerer en allerede vanskelig metode. Denne protokol giver nem adgang til øjet og dens omgivende væv, at fjerne disse hindringer, og giver samtidig nye muligheder for at undersøge de udviklingsmæssige processer inden for øjet. Denne protokol blev etableret for at studere induktion af de scleral øreknoglerne i embryonale øjet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol gør brug af etablerede væv dyrkning teknikker til at opnå vækst i en kylling øjet fra embryonale dag 8 (HH34) i vitro i 4 dage. Denne dyrkning af gitter metode blev oprindeligt beskrevet af Trowell15. Vi optimeret en protokol fra Pinto og Halls 1991 undersøgelse16 udnytter en semi-porøse membran med gitter til at studere induktive signaler mellem adskilte væv lag af embryonale kylling øje15. Brug denne metode, kulturp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Gregory Haller (Mount Saint Vincent Universitet) for hans indledende arbejde i udviklingen af protokollen. Forfatterne ønsker også at takke Nicholas Jones (Mount Saint Vincent Universitet) for sine tekniske ekspertise og bistand med optagelserne og produktion af audio/visuelle del af håndskriftet. Daniel Andrews blev støttet af midler fra MSVU og naturvidenskab og teknisk forskning Rådet i Canada (NSERC) via en Undergraduate studerende Research Award. Tamara A. Franz-Odendaal understøttes af en NSERC opdagelse Grant.
Materials
| 35 mm cell culture petri dishes | Corning | 353001 | easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| 100 mm cell culture petri dishes | Corning | 353003 | tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic |
| paper tissue | Kimtech | 34155 | Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton |
| wire mesh | n/a | n/a | stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm) |
| disposable glass pipettes | VWR | 14673-010 | Borosilicate glass disposable 5 3/4" |
| nutrient medium | Gibco | 12591-038 | Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB) |
| penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458 | 10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised |
| filter paper | Whatman | 1454 090 | semi-porous filter paper 90mm |
| fertilized chicken eggs | Dalhousie University Agricultural College | n/a | can be obtained from local farms |
| sodium chloride (NaCl) | EMD | SX0420-3 | sodium chloride crystals, reagent grade |
| 1 L glass bottle | VWR | 89000-240 | 1 L pyrex autoclavable glass bottle |
| ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | 70% molecular biology grade |
| tupperware containers | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| disposable razor blades | VWR | 55411-050 | single edge industrial razor blades (surgical carbon steel) |
| plastic spoons | n/a | n/a | store-bought and sterilized with EtOH |
| dust mask | 3M | n/a | 3M 8500 Comfort Mask |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | paraformaldehyde, reagent grade, crystalline |
| neutral-buffered formalin | Fisher Scientific | 72210 | 10% neutral buffered formalin |
| phosphate buffered saline (PBS) | n/a | n/a | 10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4) |
| 15 ml falcon tubes | VWR | 21008-216 | presterilized centrifuge tubes |
| forceps | FST | n/a | fine forceps |
| chick saline | n/a | n/a | 0.85% NaCl |
| tinfoil | n/a | n/a | store-bought |
| paper towel | n/a | n/a | store-bought |
References
- Franz-Odendaal, T. A. Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus. Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).
- Scholey, J. M. Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments. Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).
- Horakova, D., et al. Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development. Development, Growth & Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).
- Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. Electroporation of Embryonic Chick Eyes. Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).
- Roach, H. I. Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization. Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).
- Jung, H. S., et al. Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning. Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).
- McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds. Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).
- Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation. European Cells & Materials. 26, 91-106 (2013).
- Sato, T., et al. In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues. PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).
- Ochoa-Villarreal, M., et al. Plant cell culture strategies for the production of natural products. BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yu, M., et al. The developmental biology of feather follicles. The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).
- Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles. Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).
- Trowell, O. A. The culture of mature organs in a synthetic medium. Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).
- Pinto, C. B., Hall, B. K. Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick. Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).
- Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia. Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).
- Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development. Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).
