Det här protokollet beskriver de kritiska steg och försiktighetsåtgärder som krävs för att utföra enstaka cell multiplex omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion efter patch-clamp. Denna teknik är en enkel och effektiv metod för att analysera uttryck profilen av en förutbestämd uppsättning gener från en enda cell som kännetecknas av patch-clamp inspelningar.
Hjärnbarken är sammansatt av många celltyper som uppvisar olika morfologiska, fysiologiska och molekylära funktioner. Denna mångfald hämmar enkel identifiering och karakterisering av dessa celltyper, förutsättningar för att studera deras specifika funktioner. Denna artikel beskriver multiplex enda cell omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR) protokollet, vilket tillåter, efter patch-clamp inspelning i skivor, att upptäcka samtidigt uttryck för tiotusentals gener i en enda cell. Den här enkla metoden kan genomföras med morfologisk karakterisering och är allmänt tillämplig att avgöra de fenotypiska drag av olika celltyper och deras cellulära miljö, såsom i närheten av blodkärl. Principen om detta protokoll är att spela in en cell med patch-clamp teknik, skörda och omvända transkribera cytoplasmiska innehållet, och för att upptäcka kvalitativt uttrycket av en fördefinierad uppsättning gener av multiplex PCR. Det kräver en noggrann utformning av PCR primers och intracellulära patch-clamp-lösning som är förenlig med RT-PCR. För att säkerställa en selektiv och tillförlitlig utskrift kräver identifiering, denna teknik också lämpliga kontroller från cytoplasman skörd förstärkning steg. Även om försiktighetsåtgärder som diskuteras här måste följas strikt, kan praktiskt taget alla elektrofysiologiska laboratoriet använda multiplex enda cellen RT-PCR-teknik.
Hjärnbarken består av många celltyper som är inblandade i olika fysiologiska processer. Deras identifiering och karakterisering, en förutsättning för förståelsen av deras specifika funktioner, kan vara mycket utmanande med tanke på den stora morfologiska, fysiologiska och molekylära mångfald som kännetecknar kortikal cell typer1 ,2,3,4.
Encelliga multiplex RT-PCR bygger på kombinationen av patch-clamp och RT-PCR-tekniker. Det kan probe samtidigt uttryck för mer än 30 fördefinierade gener i elektrofysiologiskt identifierade celler5. Införandet av neuronala spårämne i inspelning pipetten ytterligare tillåter morfologisk karakterisering av inspelade cellerna efter histochemical Uppenbarelseboken6,7,8,9, 10. det är en mycket användbar teknik för klassificering av neuronala typer baserat på multivariat analys av deras fenotypiska drag5,9,10,11,12 ,13,14. Enskild cell multiplex RT-PCR lämpar sig också till karakterisering av icke-neuronala celler såsom astrocyter15,16,17, och kan tillämpas praktiskt taget varje hjärna struktur18, 19,20,21,22,23 och cell typ, förutsatt att de kan föras in i hela-cell konfiguration.
Denna teknik är mycket bekvämt för identifiering av cellulära källor eller mål av transmission system7,8,15,16,20,21, 24,25,26,27,28, särskilt när specifika antikroppar saknas. Det bygger på patch-clamp inspelningar från visuellt identifierade celler29, och därmed kan också inriktningen av celler i en specifik cellulär miljö8,15,16. Dessutom eftersom cytoarchitecture av hjärnvävnaden är bevarade i hjärnan skivor, möjliggör detta tillvägagångssätt också studiet av de anatomiska förhållandena kännetecknas celler med neuronala och icke-neuronala element7,8 , 18.
Eftersom denna teknik begränsas av mängden skördade cytoplasman och av effektiviteten i RT, kan detektion av mRNA uttryckt låg kopia nummer vara svårt. Även om andra metoder baserade på RNaseq teknik tillåter för att analysera det hela transkriptom av enstaka celler3,4,30,31, behöver de hög genomströmning dyra sequencers inte nödvändigtvis tillgängliga för varje laboratorium. Eftersom den enda cell multiplex RT-PCR-tekniken använder slutpunkten PCR, det enda som krävs allmänt tillgängliga thermocyclers. Det lätt kan utvecklas i laboratorier som är utrustade med elektrofysiologiska uppställningar och kräver ingen dyr utrustning. Det kan ge, inom en dag, en kvalitativ analys av uttrycket av en fördefinierad uppsättning gener. Således erbjuder denna strategi enkel tillgång till molekylär karakterisering av enstaka celler på ett snabbt sätt.
Single cell multiplex RT-PCR efter patch-clamp kan samtidigt och tillförlitligt sond uttrycket av mer än 30 gener i elektrofysiologiskt identifierade celler5. Analysera genuttryck på enstaka cellnivå kräver högeffektiva PCR primers. En av de mest begränsande steg är samling av cellens innehåll. Dess effektivitet beror på diametern på patch pipettspetsen, som måste vara så stor som möjligt medan matchande Cellstorlek. Pipetter med en 1-2 µm öppen spets diameter var visat sig vara l?…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr Alexandre Mourot för hans synpunkter på manuskriptet. Detta arbete stöds av bidrag från Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 och ANR-17-CE37-0010-03), BLG stöds av stipendium från den Fondation pour la Recherche sur Alzheimers. Vi tackar djuranläggningen av IBPS (Paris, Frankrike).
MACAW v.2.0.5 | NCBI | Multiple alignement for primer design | |
Dithiothreitol | VWR | 443852A | RT |
Random primers | Sigma-Aldrich (Merck) | 11034731001 | RT |
dNTPs | GE Healthcare Life Sciences | 28-4065-52 | RT and PCR |
RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2511 | RT |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064014 | RT |
Taq DNA Polymerase | Qiagen | 201205 | PCR |
Mineral Oil | Sigma-Aldrich (Merck) | M5904-5ML | PCR |
PCR primers | Sigma-Aldrich (Merck) | PCR / desalted and diluted at 200 µM | |
Tubes, 0.5 mL, flat cap | ThermoFisher Scientific | AB0350 | RT and PCR |
BT10 Series – 10 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT10 | RT and PCR |
BT20 Series – 20 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT20 | RT and PCR |
BT200 Series – 200 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT200 | RT and PCR |
BT1000 Series – 1000 µL Filter Tip | Neptune Scientific | BT1000.96 | RT and PCR |
DNA Thermal Cylcer | Perkin Elmer Cetus | PCR | |
Ethidium Bromide | Sigma-Aldrich (Merck) | E1510-10ML | Agarose gel electrophoresis |
Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich (Merck) | T4415-1L | Agarose gel electrophoresis |
UltraPure Agarose | Life Technologies | 16500-500 | Agarose gel electrophoresis |
ΦX174 DNA-Hae III Digest | NEB (New England BioLabs) | N3026S | Agarose gel electrophoresis |
EDA 290 | Kodak | Agarose gel electrophoresis | |
Electrophoresis Power supply EPS 3500 | Pharmacia Biotech | Agarose gel electrophoresis | |
Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13 | Sigma-Aldrich (Merck) | Agarose gel electrophoresis | |
Smooth paper with satin appearance | Fisherbrand | 1748B | Patch clamp internal solution |
Potassium Hydroxyde | Sigma-Aldrich (Merck) | 60377 | Patch clamp internal solution |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | E3889 | Patch clamp internal solution |
HEPES | Sigma-Aldrich (Merck) | H4034 | Patch clamp internal solution |
Potassium D-gluconate | Sigma-Aldrich (Merck) | G4500 | Patch clamp internal solution |
Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | M1028 | Patch clamp internal solution |
5500 Vapor Pressure Osmometer | Wescor | Patch clamp internal solution | |
Biocytin | Sigma-Aldrich (Merck) | B4261 | Patch clamp internal solution |
Sucrose | Sigma-Aldrich (Merck) | S5016 | Slice preparation |
D-(+)-Glucose monohydrate | Sigma-Aldrich (Merck) | 49159 | Slice preparation |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | S6191 | Slice preparation |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich (Merck) | 60128 | Slice preparation |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich (Merck) | 31437-M | Slice preparation |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S5011 | Slice preparation |
Magnesium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 63069 | Slice preparation |
Calcium chloride solution | Sigma-Aldrich (Merck) | 21115 | Slice preparation |
Kynurenic acid | Sigma-Aldrich (Merck) | K3375 | Slice preparation |
Isoflurane | Piramal Healthcare UK | Slice preparation | |
VT 1000S | Leica Biosystems | 14047235613 | Slice preparation |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich (Merck) | H1009 | Patch Clamp set-up cleaning |
Thin Wall Glass Capillaries with filament | World Precision Instruments | TW150F-4 | Patch Clamp |
PP-83 | Narishige | Patch Clamp | |
Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956003 | Patch Clamp |
BX51WI Upright microscope | Olympus | Patch Clamp | |
XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA | Sony | Patch Clamp | |
Axopatch 200B Amplifier | Molecular Devices | Patch Clamp | |
Digidata 1440 | Molecular Devices | Patch Clamp | |
pCLAMP 10 software suite | Molecular Devices | Patch Clamp | |
10 mL syringe | Terumo | SS-10ES | Expelling |
E Series with Straight Body (Holder) | Phymep | 64-0997 | Expelling |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S7907 | Histochemical revelation |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich (Merck) | S8282 | Histochemical revelation |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich (Merck) | P6148 | Histochemical revelation |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich (Merck) | X100 | Histochemical revelation |
Gelatin from cold water fish skin | Sigma-Aldrich (Merck) | G7041 | Histochemical revelation |
Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | S11223 | Histochemical revelation |
24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | Histochemical revelation |