Articolo metodologico

Efficiente generazione di Pancreas/duodeno Homeobox Protein 1+ posteriore del Foregut/pancreatico progenitori da hPSCs nelle culture di adesione

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DOI:

10.3791/57641

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27 marzo 2019

 ,  ,  , 
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in proteina di pancreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas basano sulla crescita di monostrato di tipo non-Colonia di dissociato singole cellule. Questo metodo è adatto per la produzione di cellule derivate da hPSC omogenee, manipolazione genetica e di screening.

Abstract

Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per la medicina rigenerativa e una piattaforma per lo studio di processi di sviluppo umani. Diretto graduale differenziazione che ricapitola i processi inerenti allo sviluppo è uno dei principali modi per generare cellule pancreatiche compreso pancreas/duodeno homeobox proteina 1+ (PDX1+) cellule progenitrici del pancreas. Protocolli convenzionali avviano la differenziazione con piccole colonie poco dopo il passaggio. Tuttavia, nello stato di colonie o aggregati, le cellule sono inclini a eterogeneita ', che potrebbero ostacolare la differenziazione per PDX1+ cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziarsi hPSCs in PDX1+ cellule. Il protocollo consiste di quattro passi e avvia la differenziazione di singole cellule dissociate di semina. L'induzione di SOX17+ cellule endoderma definitivo è stata seguita dall'espressione di marcatori di tubo due intestino primitivo, HNF1β e HNF4α ed eventuale differenziazione in PDX1+ cellule. Il presente protocollo fornisce la gestione facile e può migliorare e stabilizzare l'efficienza di differenziazione di alcune linee di hPSC che precedentemente sono stati trovati per differenziare in modo inefficiente in endodermici lignaggi o PDX1+ cellule.

Introduzione

Il pancreas è costituito principalmente da cellule esocrine ed endocrine, e sua disfunzione o sovraccarico provoca diverse malattie, come la pancreatite, diabete e cancro del pancreas. Per delucidare il pathogeny di fibrocalcolosa, è necessario analizzare il processo di sviluppo e la funzione delle cellule pancreatiche. Inoltre, per stabilire la terapia di supplementazione di cellule/tessuti è necessaria una fornitura di cellulari stabili con qualità robusta. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per questi scopi, e il protocollo di differenziazione verso le cellule del pancreas è stato intensamente studiato1,2,3, 4. Gli avanzamenti recenti nella generazione in vitro di cellule β del pancreas imitano la generazione di cellule β in adulto umano e queste cellule Visualizza efficacia terapeutica su impiantati in topi diabetici modello2,3. Inoltre, l'analisi delle cellule β generate dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di sano di tipo 1 diabete paziente donatori ha rivelato nessuna differenza funzionale tra cui quando sotto stress5. Inoltre, i fenotipi di malattia sono stati riprodotti parzialmente in cellule pancreatiche indotte con iPSCs derivate dal paziente o hPSCs che harboring le mutazioni genetiche nello stesso sito come pazienti6,7.

Per generare le cellule pancreatiche da hPSCs, graduale differenziazione diretto che ricapitola i processi di sviluppo viene utilizzata. Il pancreas è derivato dallo strato endoderma dell'embrione precoce, che esprime il sesso che determina regione Y-box 17 (SOX17) e forkhead box A2 (FOXA2)8. Basato sugli studi del mouse, lo strato endodermico forma il tubo dell'intestino primitivo, che è contrassegnato dall'espressione dell'epatocita fattore nucleare 1 beta (Hnf1β) e dell'epatocita nucleare di fattore 4-alfa (Hnf4α). Il tubo dell'intestino primitivo si allunga e si sviluppa nell'apparato respiratorio, digerente e organi. Dopo l'allungamento, la zona posteriore del foregut diventa la regione pancreatica presuntiva, come indicato dall'espressione della proteina fattore trascrizionale pancreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. Le parti dorsali e ventrali della PDX1+ gut tubo addensare a formare cime del pancreas, che sono segnati dalla co-espressione del pancreas trascrizione fattore 1 subunità alfa (PTF1A) e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Questa espressione segna l'inizio morfologico dell'organogenesi pancreatica. Cellule pancreatiche endoderma, che sono componenti delle gemme del pancreas, formano una rete ramificata tubolare di strutture epiteliali12 e alla fine differenziarsi in cellule esocrine ed endocrine, tra cui β-cellule secernenti insulina e che secernono glucagone α-cellule. Espressione di PDX1 viene rilevato in primo luogo alla regione pancreatica presuntiva, che poi è osservata durante l'intero sviluppo del pancreas e Mostra la localizzazione di cellule β - e δ-9,13,14. Anche se il Pdx1+ zona delle cellule che non esprimono Ptf1a o Nkx6.1 differenzia in antrum gastrico, del duodeno, dei dotti biliari extrahepatic e alcune cellule intestinali a metà alla fine della fase di sviluppo in topi9, PDX1+ le cellule sono considerate i progenitori del pancreas nella fase iniziale dello sviluppo negli esseri umani.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziarsi hPSCs in PDX1+ cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas. La differenziazione di iniziati di protocollo da semina dissociato celluli15,16,17. In genere, indifferenziato hPSCs sono mantenuti come colonie o aggregati cellulari in sospensione o in adesione. Di conseguenza, la maggior parte dei protocolli avviare la differenziazione poco dopo il passaggio. Tuttavia, nello stato di colonie o aggregati, le cellule sono inclini a eterogeneità spaziale e trascrizionale18,19,20,21,22, che potrebbero ostacolare la primo passo di differenziazione verso l'endoderma definitivo seguita da differenziazione inefficiente per PDX1+ cellule. Il presente protocollo può offrire maneggevolezza per migliorare e stabilizzare l'efficienza di differenziazione di alcune linee di hPSC che precedentemente sono stati trovati per differenziare inefficacemente endodermici lignaggi e PDX1+ cellule23, 24 , 25.

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Protocollo

Gli esperimenti usando hPSCs sono stati approvati dal comitato etico del dipartimento di medicina e Graduate School of Medicine, Università di Kyoto.

1. preparazione dei materiali

Nota: Preparare tutti i terreni e reagenti per colture cellulari in ambiente sterile. Caldo a base di coltura a temperatura ambiente (TA) prima dell'uso. Medio per differenziazione viene utilizzata all'interno di 6 h a RT. dettagli dei reagenti elencati nella Tabella materiali.

  1. Differenziazione (Figura 1A)
    1. Stage 1A medio: trasferimento medium RPMI 1640 in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento senza siero, activina A, CHIR99021 e Y-27632 a una concentrazione di 1 x, 100 ng/mL, 3 μM e 10 μM, rispettivamente.
    2. Stage 1B medio: trasferimento medium RPMI 1640 in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento senza siero, activina A e CHIR99021 a una concentrazione di 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, rispettivamente.
      Nota: La concentrazione di CHIR99021 deve essere inferiore a Stage 1A medio e aggiunta non è necessaria, ma aumenta il numero di cellulare.
    3. Stage 2 medio: medio di trasferimento migliorato MEM (iMEM) in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento privo di siero e il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) ad una concentrazione di 0,5 x e 50 ng/mL, rispettivamente.
    4. Stage 3 medio: mezzo di iMEM di trasferimento in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento senza siero, KGF, NOGGIN, 3-cheto-N-amminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) e acido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) mediante pipetta per concentrazioni di 0.5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM e 10 nM, rispettivamente.
  2. Citometria a flusso (FCM)
    1. Permeabilizzazione/lavaggio 1X: trasferire l'acqua in un tubo mediante una pipetta. Aggiungere tampone di permeabilizzazione/lavaggio mediante una pipetta ad una concentrazione di 1 x.
    2. FCM soluzione bloccante: trasferire Permeabilization/lavaggio 1X in una provetta mediante una pipetta. Aggiungere asino siero mediante una pipetta ad una concentrazione del 2% (vol/vol).
  3. Immunostaining
    1. Soluzione bloccante: Phosphate-Buffered Saline (DPBS di trasferimento Dulbecco) in un tubo mediante una pipetta. Aggiungere siero asino e Triton X mediante pipetta a concentrazioni di 5% (vol/vol) e 0,4% (vol/vol), rispettivamente.

2. hPSC differenziazione ai progenitori di cellule/pancreatico posteriore del Foregut (PDX1 cellule+ )

Nota: Effettuare tutte le procedure usando tecniche sterili. hPSCs sono mantenuti su piastre da 6 pozzetti rivestite da un materiale di superficie sintetico per hPSCs con hPSC mezzo di manutenzione secondo le istruzioni17,26 del produttore. Quando le cellule di raggiungere confluency di 50-80% (stadio 0) li usano per differenziazione.

  1. Preparare della membrana dello scantinato piastre rivestite con matrice.
    1. Trasferimento 6 mL di RPMI 1640 (4 °C) in una provetta raffreddata a 4 °C sul ghiaccio. Aggiungere 2 mg di matrice della membrana basale (4 °C) con 1 mL-puntali per pipette raffreddato e mescolare bene di pipettaggio delicato per rendere la matrice della membrana basale di 0,33 mg/mL.
    2. Trasferire 2 mL di matrice della membrana basale diluito in ciascun pozzetto di piastre per colture cellulari a 6 pozzetti mediante una pipetta. Posizionare le piastre a 37 °C per 60-90 min in un'incubatrice. In seguito, tenere le piastre a temperatura ambiente fino all'utilizzo (all'interno di 3 h).
  2. L'hPSCs di semi e avviare la differenziazione di endoderma definitivo (1A tappa).
    1. Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di 0.5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (RT) per pozzetto mediante pipetta per lavare l'hPSCs coltivati nelle piastre 6 pozzetti.
    2. Aspirare 0,5 mM EDTA e aggiungere 2 mL di 0.5 mM EDTA per pozzetto mediante pipetta. Incubare le piastre a 37 °C per 5 min.
    3. Aspirare 0,5 mM EDTA e aggiungere 1 mL di mezzo di manutenzione hPSC presso RT completati con 10 μM Y-27632 per bene dalla pipetta. Pipettare delicatamente ma rapidamente per soffiare via la cellule allegate sulle piastre e dissociare le cellule ragruppate in singole celle. Non bolla sospensione delle cellule durante il pipettaggio.
    4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 50 mL contenente 4 mL di mezzo di manutenzione hPSC presso RT completati con 10 μM Y-27632. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare.
    5. Contare il numero di cellule in sospensione delle cellule usando la procedura di esclusione del Trypan Blue macchia.
      1. Mix 15 µ l di sospensione cellulare e 15 μL di Trypan blu in un tubo.
      2. Trasferire 10 μL della sospensione delle cellule diluita con Trypan Blue su cella contando diapositive in duplicato mediante una pipetta da 10 μL.
      3. Contare la cella numero con un contatore di cellule automatico e calcolare la densità delle cellule in sospensione delle cellule. Vitalità è di solito > 98%.
    6. Aliquotare la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 50 mL a 1-1,5 x 106 cellule per pozzetto di piastre da 6 pozzetti (1-1.5 x 105 cellule/cm2).
    7. Centrifugare la provetta 50 mL a 200 x g per 5 min a RT.
    8. Aspirare il surnatante con una pipetta e risospendere le cellule con 1 mL di terreno di 1A fase (RT) per pozzetto. Delicatamente Pipettare la sospensione cellulare e aggiungere un altro 1 mL di mezzo di fase 1A (totale, 2 mL per pozzetto).
    9. Aspirare la matrice della membrana dello scantinato diluiti nei pozzetti delle piastre di coltura cellulare preparate al punto 2.1.2 mediante una pipetta μL 1.000. Procedere al passaggio successivo immediatamente.
    10. Delicatamente dispensare la sospensione di eritrociti nel passaggio 2.2.8 nuovamente. Immediatamente dopo la miscelazione, trasferire la sospensione cellulare (2 mL) in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggere la piastra dalla luce. Collocare la piastra nel banco pulito a temperatura ambiente per 10-15 min.
      Nota: Non spostare la piastra dopo la semina.
    11. Posizionare delicatamente la piastra in un 37 °C, 5% CO2 incubator (atmosfera umidificata) e cultura per 24 h.
      Nota: Non agitare la piastra dopo la semina.
  3. Indurre la differenziazione in endoderma definitivo (fase 1B).
    1. Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS ai pozzetti mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
      Nota: Per rimuovere eventuali cellule morte da strato monomolecolare, scuotere delicatamente la piastra prima di ogni aspirazione.
    2. Aspirare il DPBS usato mediante una pipetta e aggiungere 4 mL di Stage 1B medio (37 °C) per pozzetto. Posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore a 37 °C (atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 48 h.
    3. Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
      Nota: Rimuovere le cellule morte dal monostrato di agitazione delicata prima di ogni aspirazione.
    4. Aspirare il DPBS usate mediante pipetta e aggiungere 4 mL di Stage 1B medio (37 °C) per pozzetto. Posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore (37 °C, atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 24 h.
  4. Indurre il differenziamento nel tubo dell'intestino primitivo (fase 2).
    1. Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta.
      Nota: Rimuovere le cellule morte dal monostrato di agitazione delicata prima di ogni aspirazione.
    2. Aspirare il DPBS usate mediante pipetta e aggiungere 4 mL di terreno di fase 2 (37 °C) per pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 4 giorni.
  5. Indurre il differenziamento in PDX1+ cellule (fase 3).
    1. Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
    2. Aspirare il DPBS usate mediante pipetta e aggiungere 4 mL di terreno di fase 3 (37 °C) per pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 3 giorni.
  6. Indurre la differenziazione in cellule endocrine del pancreas.
    1. Eseguire induzione di cellule NKX6.1+ (fase 4, per 8 giorni) seguita da induzione endocrina delle cellule (fase 5, per 12 giorni) con protocolli precedentemente descritti3,16,26. Caratterizzano e convalidare la differenziazione endocrina delle cellule di immunostaining e analisi quantitativa in tempo reale trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena (qRT-PCR).
      Nota: Fare riferimento alla Toyoda et al.16 e Kimura et al.26 per dettagliate procedure sperimentali. Consultare la tabella 1 per sequenze primer utilizzate per analisi qRT-PCR.

3. citometria di flusso (FCM)

  1. Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di 0.5 mM EDTA al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di 0,5 mM EDTA una volta.
    Nota: Agitare la piastra delicatamente per rimuovere eventuali cellule morte dalle cellule dello strato monomolecolare prima di ogni aspirazione.
  2. Per dissociare le cellule (circa 3-6 × 106 cellule per pozzetto), aggiungere 2 mL di 0,25% tripsina contenente 0,5 mM EDTA per pozzetto. Incubare le piastre a 37 °C per 5-10 min.
  3. Pipettare delicatamente ma rapidamente a dissociare le cellule di ragruppata in singole celle. Non bolla sospensione delle cellule durante il pipettaggio.
  4. Aggiungere 8-10 mL di terreno base (RPMI 1640 o iMEM, RT) contenente 0,5 x integratore privo di siero e 10 μM Y-27632 per bene e mescolare la sospensione cellulare. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga.
  5. Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min a RT.
  6. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 2 mL di 0.5 mM EDTA (RT). Pipettare delicatamente la sospensione cellulare.
  7. Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min a RT.
  8. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 100 μL di tampone di fissazione e permeabilizzazione per 106 cellule sotto una cappa. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare sotto una cappa. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 30 min.
  9. Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 min a RT.
  10. Aspirare il supernatante sotto un cofano e risospendere le cellule con 500 μL di soluzione di FCM blocco per 106 cellule. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 30 min.
  11. Trasferire 50 μL della sospensione delle cellule in una provetta (circa 1 x 105 cellule). Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 100 µ l di anticorpo primario diluito (Vedi Tabella materiali) in FCM soluzione di blocco e incubare a 4 °C per > 16 h.
  12. Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 180 μL di tampone di lavaggio/Perm 1x.
  13. Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 100 µ l di anticorpo secondario diluito (Vedi Tabella materiali) in FCM soluzione bloccante. Incubare le cellule a RT per 60 min o a 4 °C per > 16 h con protezione dalla luce.
  14. Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 180 μL di tampone di lavaggio/Perm 1x.
  15. Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 180 μL di siero asino 2% in DPBS.
  16. Filtrare la sospensione cellulare trasferendo un 5 ml provetta polistirolo con un filtro cella (rete di nylon 35 µm) e conservare a 4 °C con protezione dalla luce fino all'analisi.
  17. Analizzare una percentuale di cellule marcate positivamente da un cytometer di flusso27.

4. Immunostaining

  1. Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
    Nota: Scuotere delicatamente la piastra per rimuovere eventuali cellule morte dalle cellule dello strato monomolecolare prima di ogni aspirazione.
  2. Aggiungere 2 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) (4 °C) per pozzetto mediante pipetta sotto una cappa. Tenere la piastra a 4 °C per 20 min.
  3. Rimuovere il PFA pipetta sotto una cappa. Aggiungere 2 mL di DPBS presso RT al pozzo mediante pipetta sotto una cappa. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
  4. Aggiungere 2 mL di soluzione bloccante per pozzetto e tenere la piastra a temperatura ambiente per 30 min.
  5. Aspirare la soluzione usata e aggiungere 1 mL di anticorpo primario (Vedi Tabella materiali) nella soluzione per pozzetto di blocco. Incubare a temperatura ambiente per 60 min o a 4 °C per > 16 h.
  6. Aspirare la soluzione usata, aggiungere 2 mL di DPBS contenente 0,4% Triton X-100 e incubare a + RT 10 min ripetere l'aspirazione, aggiunta di soluzione e incubazione una volta.
  7. Aspirare la soluzione usata e aggiungere 1 mL di anticorpo secondario (Vedi Tabella materiali) nella soluzione per pozzetto di blocco. Incubare a temperatura ambiente per 60 min con protezione dalla luce.
  8. Aspirare la soluzione usata, aggiungere 2 mL di DPBS contenente 0,4% Triton X-100 (RT) e incubare a temperatura ambiente per 5 min con protezione dalla luce. Ripetere l'aspirazione, aggiunta di soluzione e incubazione due volte.
  9. Prendere micrografie per esaminare l'efficacia di differenziazione sotto un microscopio di fluorescenza28.

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Risultati

Moltiplicazione delle hiPSCs (585A129,30) sono condensati e formano un monostrato omogeneo (Figura 1B) che è adatto per differenziazione. HiPSCs indifferenziato (stadio 0) sono dissociate e ri-seminato come singole cellule a densità bassa delle cellule (1-1.5 x 105 cellule/cm2). Entro 1 h, le cellule sono attaccate alla piastra e iniziano a mostrare la protrusione. Il giorno 1, le cellule sono moltiplicate e ben...

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Discussione

La generazione di PDX1+ cellule è composto da più passaggi; Pertanto, è fondamentale per il trattamento di cellule al momento opportuno. Tra i passaggi, l'efficienza di induzione dell'endoderma definitivo colpisce in gran parte l'efficienza finale induzione, possibilmente da interferenze provenienti da altre cellule lignaggio contaminanti (cioè, mesoderma ed ectoderma), che possono proliferare e/o secernono fattori che compromettere la differenziazione specifica. Se la proporzione di SOX17+ cellule ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato in parte sostenuto da finanziamenti della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) attraverso Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 e 18 K 08510) al T.T. e sovvenzione per assegnisti di ricerca pagine JSP (Javaserver KAKENHI Grant numero 17J07622) di A.K. e l'Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo (AMED) attraverso la sua ricerca concedere "Core Center for iPS Cell ricerca, centro di ricerca rete per realizzazione di medicina rigenerativa" per K.O. Gli autori ringraziano il Dr. Peter Karagiannis per leggere il manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
acido 3-cheto-N-amminoetil-N′-amminocaproyldiidrocinnamoilciclopaminaToronto Research ChemicalsK171000CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetraidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]-benzoicoSanta Cruz BiotechnologySC-203303TTNPB
50 mL Provette da centrifuga sterili sterili conichein polipropilene Thermo Fisher Scientific339652
Anticorpo anti-CDX2 [EPR2764Y]AbcamAb76541Anti-CDX2, &volte; 1/1000 diluizione
B-27 Integratore (50 &volte;)Thermo Fisher Scientific17504-044Integratore senza siero
BD FACSAria II Cell SorterBD BiosciencesPer citometria a flusso
Congelatore biomedicoSANYOMDF-U538Per -30 ° C per la conservazione
dei vetrini per il conteggio delle cellule per il contatore di cellule TC10/TC20, a doppia cameraBIO-RAD1450011Vetrino per il conteggio
PIASTRA MULTIPOZZETTO PER COLTURA CELLULARE, 6 POZZETTI, PS, TRASPARENTEGreiner bio-one657165Per la coltura di differenziazione/piastra a 6 pozzetti
CentrifugaTOMYAX-310Per la coltura cellulare
CentrifugaTOMYMX-305Per RT-qPCR
CHIR99021Axon MedchemAxon 1386
PANCA PULITASHOWA KAGAKU S-1601PRVBanco pulito
Corning CellBIND Piastra a 6 pozzettiCorning3335Per colture senza alimentatore di hPSC/piastra a 6 pozzetti
Corning Matrigel Matrice della membrana basale Fattore di crescita ridottoCorning354230Matrice della membrana basale
Corning Synthemax II-SC SubstratoCorning3535Per colture senza alimentatore di hPSC/materiale sintetico di superficie per hPSC
CriostatoLeicaLeica CM1510 SPer l'immunocolorazione di aggregati.
Kit Cytofix/CytopermBecton Dickinson554714tampone Perm/Wash è  Permeabilizzazione/Tampone di lavaggio. Il tampone Cytofix/Cytoperm è un tampone di fissazione e permeabilizzazione.
Dako penDakoS2002Per l'immunocolorazione di aggregati
dNTP mix (10 mM)Thermo Fisher Scientific18427-088Per RT-qPCR
Asino anti-IgG di capra (H+L) Anticorpo secondario adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11055Anticorpo secondario, &volte; 1/500 diluizione Asino
anti-Topo IgG (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036Anticorpo secondario, &volte; diluizione 1/500
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio d'asino (H+L), Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10040Anticorpo secondario, & volte; diluizione 1/500
Siero d'asinoMerck MilliporeS30Siero d'asino
D-PBS(-) senza Ca o MgNacalai tesque14249-95DPBS
Essential 8 MediumThermo Fisher ScientificA1517001Per colture senza alimentatore di hPSC/terreno di mantenimento hPSC
Provetta in polistirene a fondo tondo Falcon da 5 mL, con filtro cellulare Tappo a scattoCorning352235Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL con filtro a celle
Puntale filtrante, 1.000 &; LWatoson124-1000SUtilizzare insieme alle pipette Puntale
con filtro, 20 &; LWatoson124-P20SUtilizzare insieme a pipette Puntale
con filtro, 200 &; micro; LWatoson124-P200SUtilizzare insieme alle pipette
Microscopio a fluorescenzaKeyenceBZ-X700Per l'immunocolorazione
Forma Steri-Cycle CO2 incubatoreThermo Fisher Scientific370A
incubatore HNF-1β Anticorpo (C-20)Santa Cruz Biotechnologysc-7411Anti-HNF1β, &volte; 1/200 diluizione
HNF-4&alfa; Anticorpo (H-171)Santa Cruz Biotechnologysc-8987Anti-HNF4α, &volte; 1/200 diluizione
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Per la colorazione del nucleo, &volte; 1/200 diluizione
Pancreas umano RNA totaleAmbionAM7954Per RT-qPCR
Umano PDX-1/IPF1 AnticorpoR& D SystemsAF2419Anti-PDX1, IgG di capra, &volte; 1/200 diluizione
Anticorpo umano SOX17R& D SystemsAF1924Anti-SOX17, &volte; diluizione 1/200
Zinco MEM migliorato Opzione mediaThermo Fisher Scientific10373-017
Camera di incubazioneCosmo Bio10DOPer l'immunocolorazione degli aggregati Guanti da
esplorazione in latticeAdachi
MAS rivestito vetrinoscorrevole Matsunami Glass83-1881Per immunocolorazione degli aggregati
MicroAmp Piastra di reazione veloce a 96 pozzettiApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907RT-qPCR
OlympusCKX41N-31PHPPer la coltura cellulare
MicrotuboWatoson131-515CS
Monoclonale Anti-&alfa;-FetoproteinaSIGMAA8452Anti-AFP, &volte; diluizione 1/200
Nanodrop 8000Thermo Fisher Scientificper RT-qPCR
Oligo dTFASMACOligo su misuraPer RT-qPCR di sequenza è "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
Paraformaldeide, polvereNacalai tesque26126-54PFA, fissativo, diluito in DPBS
Frigorifero farmaceuticoSANYOMPR-514per 4 ° C stoccaggio
PIPETMAN P GILSONPipetta
Umana Ricombinante KGF/FGF-7R& D Systems251-KGKGF
Noggin umana ricombinantePeproTech120-10CNOGGIN
Activina umana/topo/ratto ricombinante A& D Systems338-ACActivin A
ReverTra Ace (100 U/μ L)TOYOBOTRT-101Per RT-qPCR
Set di DNasi senza RNasi (50)QIAGEN79254Per RT-qPCR
RNeasy Mini KitQIAGEN74104Per RT-qPCR
RPMI 1640 con L-GlnNacalai tesque30264-85RPMI 1640
Pellicola sigillante per Real TimeTakaraNJ500Per RT-qPCR
Pipette sierologiche 10 mLCostar/Corning4488Per la coltura cellulare
Pipette sierologiche 25 mLCostar/Corning4489Per la coltura cellulare
Pipette sierologiche 5 mLCostar/Corning4487Per la coltura cellulare
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAbSegnalazione cellulare3579SAnti-SOX2, &volte; 1/200 diluizione
StepOnePlusApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientificoper RT-qPCR
SaccarosioNacalai tesque30406-25Per immunocolorazione di aggregati
TB Green
Premix Ex Taq II 		TakaraRR820Bper RT-qPCR
TC20 Contatore di cellule automatizzatoBIO-RAD1450101J1Contatore di cellule automatico
Tissue-Tek OCT composto 4583 Sakura Finetechnical4583Per l'immunocolorazione di aggregati
Tissue-Tek Cryomold Stampi/Adattatori SakuraFinetechnical4566Per l'immunocolorazione di aggregati
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
Trypan BlueBIO-RAD1450021
Congelatore ultrafreddoSANYOMDF-U33VPer -80 ° C che conserva
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific15575-038Diluire con DPBS per preparare 0,5 mM EDTA
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems/Thermo Fisher Scientificper RT-qPCR
Y-27632Wako251-00514
iMEM Per microscopio "

Riferimenti

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