Здесь мы описываем протокол для исследования prenylation и 5'-гуанозинтрифосфатом (GTP)-Загрузка Rho ГТФазы. Этот протокол состоит из двух подробных методов, а именно мембраны фракционирования и связаны ГТФазы иммуноферментного анализа. Протокол может использоваться для измерения prenylation и GTP загрузки различных других малых GTPases.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Rho ГТФазы семья принадлежит к надсемейства ран и включает в себя около 20 членов в организме человека. GTPases Ро имеют важное значение в регуляции различных клеточных функций, включая цитоскелета динамики, подвижности клеток, клеток полярности, аксональное руководство, везикулярной людьми и клеточного цикла управления. Изменения в Rho ГТФазы сигнализации играют важную роль регулирования в многих патологических состояний, таких как рак, заболевания центральной нервной системы и иммунной системы зависимых заболеваний. Посттрансляционная модификация Ро GTPases (то есть, prenylation, интермедиатов мевалоната путь) и GTP привязки являются ключевыми факторами, которые влияют на активации этого белка. В этом документе две основные и простые методы предоставляются для выявления широкого спектра Rho ГТФазы prenylation и GTP привязку деятельности. Разъясняются детали технических процедур, которые использовались шаг за шагом в этой рукописи.
Введение
Ро GTPases представляют собой группу небольших белков (21-25 кДа), которые хорошо сохраняются на протяжении эволюции и образуют уникальный подсемейство в РАН надсемейство малых GTPases. В каждом подсемейство в пределах этого надсемейства существует общий G домена ядро, которое участвует в деятельности ГТФазы и нуклеотидов обмен1. Разница между Ро семьи и других подсемейств РАН является наличие «Ро Вставка домена» в рамках 5й β прядь и 4й α спирали в небольшой ГТФазы домена2.
Основываясь на недавних классификации, Ро GTPases считаются семейство сигнализации белки, которые ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Определение RhoA локализации с помощью мембраны/цитозоль фракционирования
-
Клеток культуры и симвастатин лечение
- Семя 50000 U251 клетки в 100 мм блюдо и культуры их в Дульбекко изменение средних орла (DMEM) (высокая глюкозы, 10% плода бычьим сывороточным [FBS]).
- Когда 30% притока, лечить клетки путем удаления среды и добавления к нему (10 мкм СИМВАСТАТИН, растворенных в диметилсульфоксида [ДМСО]) симвастатин содержащих среднего и инкубировать в течение 36 часов при 37 ° C8. Использование ДМСО только как элемент управления транспортного средства.
Примечание: 10 миллионов клетки необходимы для....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Фракционирование мембраны:
Ultracentrifugation был использован для фракционирования мембраны и цитозоле компонентов. Как показано на рисунке 1, супернатанта содержит цитозольной фракции и гранулы содержит часть мембраны. Обилие RhoA в andmembrane цитозольной фракции, полученные из клеток U251 был рассмотрен после лечения с СИМВАСТАТИН, используя immunoblotting. Чистота и контроля ме.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем точный метод измерения малых ГТФазы prenylation и GTP привязки, показанный как малые ГТФазы субцеллюлярные локализации (мембраны против цитозоль) и Ро GTP загрузки. Малые GTPases выражаются в эукариотических клетках и играть существенную роль в пролиферации и моторики, структура. Prenylation и GTP привязки участвуют в регулирование деятельности ГТФазы; Таким образом анализы для оценки prenylation и GTP привязку этих белков являются важными инструментами для клеток биологи1
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Саид Ghavami было поддержано Грант операционной центра науки здоровья, CHRIM, Грант и исследования Манитоба новый следователь операционной Грант. Джавад Ализаде было поддержано исследований Манитоба студенчества. Шахла Шоджаеи было поддержано здоровье науки фонд действующих грантов и ускорить MITACS докторантура стипендий. Адель Резаи Могадам был поддержан Сенти операционной Грант, который был проведен, Джозеф у. Гордон. Амир а. Zeki было поддержано NIH/NHLBI K08 премии (1K08HL114882-01A1). Марек J. Лос любезно признает поддержку от НКС Грант #2016/21/B/NZ1/02812, поддержке LE STUDIUM института передовых исследований (регион центр-Валь-де-Луар, Франция) через программ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM с высоким содержанием глюкозы | VWR (Канада) | VWRL0101-0500 | |
| Фетальная бычья сыворотка | VWR (Канада) | CA45001-106 | |
| Пенициллин/стрептомицин | VWR (Канада) | 97062-806 | |
| ЭДТА (этилендиамин тетрауксусная кислота) | VWR (Канада) | CA71007-118 | |
| EGTA (этиленгликоль бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N'- тетрауксусная кислота) | VWR (Канада) | CAAAJ60767-AE | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | VWR (Канада) | CA97061-340 | |
| Персульфат аммония | VWR (Канада) | CABDH9214-500G | |
| Трис-гидроксиметиламинометан | VWR (Канада) | CA71009-186 | |
| 30% раствор акриламида/биса | Biorad (Канада) | 1610158 | |
| TEMED | Biorad (Канада) | 1610801 | |
| коктейль ингибиторов протеазы | Sigma/Aldrich (Канада) | P8340-5ML | 1:75 разведение |
| Rho-GTPase Антитела Sampler Kit | Cell Signaling (Канада) | 9968 | 1:1000 разведение |
| пан-кадгеринового антитела | Cell Signaling (Канада) | 4068 | 1:1000 разведение |
| антитела GAPDH | Santa Cruz Biotechnology (США) | sc-69778 | 1:3000 |
| Разведение RhoA G-LISA Активационный анализ (формат люминесценции) | Cytoskeleton Inc. (США) | BK121 | Цитоскелет I. Техническое руководство по активационным анализам G-LISA. 2016.RhoA |
| Антитело | Клеточная сигнализация | 2117 | |
| ECL | Amersham-Pharmacia Biotech | RPN2209 | |
| Anti-Rabbit IgG (цельная молекула) Пероксидазное антитело | Sigma | A6154-1ML | |
| SpectraMax iD5 Многорежимный микропланшетный ридер | Молекулярные устройства | 1612071A | Спектрофотометр |
| Nonidet P-40 | Sigma | 11332473001 | неденатурирующее моющее средство, октилфеноксиполиэтоксиэтанол |
| DMSO | Sigma | D8418-50ML | |
| PBS | Sigma | P5493-1L | |
| Коктейль ингибиторов фосфатазы | Sigma | P5726-5ML | 1:75 Разбавление |
Ссылки
- Yeganeh, B., et al. Targeting the mevalonate cascade as a new therapeutic approach in heart disease, cancer and pulmonary disease. Pharmacology & Therapeutics. 143 (1), 87-110 (2014).
- Valencia, A., Chardin, P., Wittinghofer, A., Sander, C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
