Mindre arbejdere af myre arter Colobopsis explodens er dissekeret for at isolere den voks-lignende indhold lagret i deres hypertrofisk mandibular kirtel reservoirer for efterfølgende opløsningsmidler-udvinding og analyse ved gaskromatografi-massespektrometri. Annotation og identifikation af flygtige bestanddele ved hjælp af open source software MetaboliteDetector er også beskrevet.
Formålet med dette manuskript er at præsentere en protokol, der beskriver metabolomic analysen af Bornean ‘eksploderende myrer’ tilhører gruppen Colobopsis cylindrica (COCY). Til dette formål er model art C. explodens brugt. Myrer tilhører den mindre arbejdstager kaste besidder særprægede hypertrofisk mandibular kirtler (MGs). I territoriale kamp bruger de de tyktflydende indholdet af deres udvidede mandibular kirtel reservoirer (MGRs) til at dræbe rivaliserende leddyr i karakteristiske selvmorderisk ‘eksplosioner’ af frivillige Bristning af den gastral integument (autothysis). Vi viser dissektion af arbejdstager myrer af denne art til isolering af den gastral del af voks-lignende MGR indholdet samt liste over de nødvendige skridt, der kræves for opløsningsmidler-udvinding af de deri indeholdte flygtige forbindelser med efterfølgende gas kromatografi-massespektrometri (GC-MS) analyse og formodede identifikation af metabolitter indeholdt i uddrag. Dissektion procedure er udført under kølet betingelser og uden brug af enhver dissektion bufferopløsning til at minimere ændringerne i den kemiske sammensætning af MGR indholdet. Efter opløsningsmiddel-baseret udvinding af flygtige metabolitter deri, præsenteres de nødvendige skridt til at analysere prøver via væske-injektion-GC-MS. Endelig, databehandling og formodede metabolit identifikation med brugen af open source-software MetaboliteDetector er vist. Med denne tilgang, profilering og identifikation af flygtige metabolitter i MGRs af myrer tilhører COCY gruppe via GC-MS og MetaboliteDetector softwaren blive muligt.
Det overordnede mål for arbejdsprocessen præsenteres her er den generelle undersøgelse af kemiske sammensætninger i sekreter af insekter. Dette gøres med det primære formål at belyse de økologiske roller af sekretion som helhed, eller enkelt forbindelser deraf. Derudover er vi interesseret i at undersøge de metabolske processer underliggende forbindelser findes i de respektive sekreter. Især kirtel indholdet fra myrer (Hymenoptera, Formicidae) har vundet stigende interesse i de seneste år, fordi de giver kilder hidtil uudforskede potentielt bioaktive stoffer (lim, antimikrobielle stoffer, osv.),1, 2. mindre arbejdstager myrer i nogle arter der hører til COCY gruppe3,4 kan fastsætte sådanne forbindelser, der findes i deres hypertrofisk MGRs, som strækker sig fra mouthparts at gaster5,6. Når truet af formodede fjender, mindre arbejdstagere af C. explodens7 og nogle relaterede arter kan gøre brug af deres MGR indhold på en usædvanlig måde: de ofrer sig af brud deres gastral mur hen til udsende det klistrede indholdet af den MGRs eksplosivt på modstanderen, dø hvorefter de formodede fjende er tilbageholdt og kan endda5,6,8,9. Formålet med udviklingen og anvendelsen af de heri præsenteres metoder var at hjælpe med at forbedre forståelsen af den kemiske sammensætning og art af forsøgsvis giftige bestanddele af denne myre sekretion.
Med henblik herpå præsenterer vi en protokol til dissektion af C. explodens arbejdstager myrer til at opnå den gastral del af deres voks-lignende MGR indholdet med efterfølgende opløsningsmidler-udvinding og analyse af GC-MS.
GC-MS analyse er en af de veletablerede metoder til profilering og identifikation af flygtige metabolitter (volatilome) fra insekter. Typiske analysander interesse for myrer omfatter cuticular kulbrinter10, semiochemicals11, og i almindelighed, forbindelser med biologisk aktivitet12. Prøver kan opnås fra hele dyr eller dele af kroppen og væsker isoleret via dissektion af insekt13,14. Prøven forberedelse teknikker omfatter udvinding af de deri indeholdte metabolitter med brugen af opløsningsmidler14 eller headspace-solid-fase-microextraction (HS-SPME)15.
Metabolomic undersøgelser er det afgørende, at prøverne er frosset hurtigt direkte efter prøvetagning, for at minimere ændringer i kemisk sammensætning og mængde af forbindelser. Myrerne anvendes til denne undersøgelse blev dræbt af Hurtig nedfrysning på stedet i en cool taske fyldt med frosset kolde pakninger. Prøverne blev derefter lagret i en-20 ° C fryser ved hjælp af generator-drevet elektricitet, før de transporteres til laboratoriet på tøris. Dissektion proceduren præsenteres her tilbyder muligheden for at isolere MGR indholdet uden at analysere hele Myren eller gaster som helhed, som det er sket inden for forskellige COCY arter16,17,18. Derudover muliggør præsenteres protokollen også direkte adgang og analyse af de omkringliggende kirtler og væv, som venom kirtel (VG)5,8, den Dufour kirtel (GD)8eller tarmene i andre biologiske undersøgelser, eller at kontrollere for eventuelle cross-forureninger indført under håndtering eller dissektion af myrer. For at minimere ændringerne i den kemiske sammensætning af MGR indholdet under dissektion, enten af optøningen prøver eller ved hjælp af kemikalier, var dissektion processen optimeret til at blive gennemført på en kold pack (-20 ° C), uden brug af enhver yderligere buffere, vask løsninger, eller opløsningsmidler. De prøver via denne metode er velegnet til besvarelse af kvalitative og kvantitative spørgsmål.
Dataanalyse formodede metabolit annotation og identifikation sker via open source-software MetaboliteDetector19, som blev udviklet til automatisk analyse af GC-MS-baseret metabolomics data. Det registrerer enkelt ion toppe i kromatogrammer, udfører et deconvolution skridt, og uddrag de deconvoluted massespektre af kemiske forbindelser, der findes i de analyserede prøver. Formodede identifikation af forbindelser med MetaboliteDetector er baseret på beslutsom fastholdelse indeks (RI; Kovats RI kan beregnes automatisk af softwaren) og ligheden mellem de deconvoluted massespektre. RI og spektral match faktor kan krydscheckes imod enten eksisterende reference-biblioteker, (der kan importeres, hvis de er i formatet fælles NIST), eller mod en etableret in-house bibliotek. Dette er i overensstemmelse med retningslinjerne for (formodede) sammensatte identifikation foreslog, fxaf den kemiske analyse arbejder gruppe (CAWG) af Metabolomics standarder initiativ (MSI), hvor mindst to uafhængige og ortogonale data i forhold til et autentisk stof (her fastholdelse tid (RT) /RI og masse spektrum) analyseret identiske forsøgsbetingelser er foreslået som nødvendigt at bekræfte ikke-roman metabolit identifikationer20.
Det komplette eksperiment er gennemført på MGR indholdet af COCY model art C. explodens, men trinene dissektion kan også tilpasses isolere andre kirtler i ant gaster. Desuden, mens vi præsentere en protokol for den omfattende analyse af volatilome af MGR indhold, de mere generisk dele af arbejdsprocessen beskriver udvinding, GC-MS måling og data evaluering kan også bruges til analyse og (formodede) identifikation af flygtige metabolitter i almindelighed.
Da de eksperimenter, der er beskrevet i dette håndskrift er udført på insekter, er ingen etiske godkendelse påkrævet. Feltarbejde, prøveudtagning af myrer, samt deres anvendelse til offentliggørelse er i overensstemmelse med de retningslinjer, der regulerer dette projekt gennem Universiti Brunei Darussalam, Bruneis forskning og Innovation Centre og Brunei Forestry Department, Brunei Darussalam.
I dette manuskript præsenterer vi en fuldstændig protokol til at analysere volatilome af det indhold, der findes i de hypertrofisk MGRs af C. explodens mindre arbejdstager myrer. Da myrerne bruges her kan ‘eksplodere’ og skubbe deres MGR indholdet i en ukontrolleret måde ved berøring med pincet, anbefales det at bruge en ‘blød’ samling teknik som fastsat af et insekt indsugningsventil (figur 1). For nogle myre arter herunder COCY myrer, kan det være nødvendigt at begrænse det maksimale antal myrer til fem personer pr. 50 mL hætteglas, da ellers selv forgiftning af myrerne (f.eks. ved ophobning af myresyre i headspace) kan forekomme. Til frysning myrer i feltet, kan en cool taske fyldt med frosset kolde pakninger anvendes. Prøverne bør være hurtigt frosset og opbevares i kølet betingelser (fx, -20 ° C, bedst ved-80 ° C), men det anbefales ikke at dræbe og gemme myrer i flydende kvælstof, da øget beskadigelse af deres kirtler er blevet observeret med denne metode.
Metoden præsenteres buffer og opløsningsmiddelfri dissektion er velegnede til at opnå voks-lignende mandibular kirtel reservoir indholdet samt andre kirtler i frosne arbejdstager myrer. Volatilome analyse af MGR indholdet af C. explodenser vigtige aspekter skal betragtes under dissektion kontinuerlig køling af ant (trin 2.1.4) og minimere cross-forureninger af MG prøver med andre kirtel indhold/væsker i ant gaster (trin 2,5, fig. 4og Figur 15). En betydelig brøkdel af de frosne myrer kan være beskadiget, enten fordi myrerne ‘eksploderede’ ved udtagning eller blev beskadiget under transport på tøris fra prøvetagningsstedet til laboratoriet. Hvis regionen gaster er brudt, er disse myrer ikke egnet til videre analyse (figur 2 c, D). Hvis kun antenner og ben er mangler eller er brudt, kan disse myrer stadig anvendes til udvinding af MGR indholdet og yderligere analyse. Da MGR indholdet af afkølet har C. explodens myrer en voks-lignende konsistens det er ligetil at isolere dem med brug af dissektion nåle (trin 2.5, figur 3og Figur 14). Ekstra pleje skal tages mens håndtering af den klæbrige MGR indhold. Det kan holde til noget, der kommer i fysisk kontakt med det og vil ofte også overholde dissektion pincet, hvilket øger risikoen for kontaminering af andre prøver. Det er nødvendigt at kun røre MGR indhold med dissektion nålen og straks overføre det ind i hætteglas anvendes til ekstraktion (trin 2.5 og 2.6). Endvidere, det anbefales at rengøre dissektion udstyr med en MeOH/H2O blanding, når du skifter mellem myrer eller kirtel-typer (trin 2.8).
Kirtel indholdet af andre myre arter kan være til stede i en flydende tilstand selv under afkøling med kolde pakninger. I dette tilfælde være hele kirtlen herunder membranen kan først isoleret og punkteret bagefter for at hente indholdet. Flydende sekret kan også opnås ved hjælp af fine kapillær pipetter. Med en gennemsnitlig kropslængde på omkring 4-5 mm (uden antenne) hører arbejdstagere af C. explodens til de mindre arter af gruppen COCY. Deres ofte hævede gaster består af ca. 2-2,5 mm i længden og 1-1,5 mm i bredden. Arbejdere i den så langt største kendte arter af gruppen COCY kan nå en størrelse på ca 8 mm i længde med en gaster størrelse på omkring 3 mm i længden og 2,5 mm i bredden. Da protokollen er velegnet til at dissekere og undersøge individuelle myrer og gasters af denne størrelse af forskellige COCY arter, her anvendte dissektion instrumenter og mikroskop eventuelt skal tilpasses for at være gældende for mindre myrer eller mindre organer. Desuden skal antallet af myrer pr. analyseprøve muligvis øges samt.
Mens dissekere ant for MGR indhold, er det vigtigt ikke at beskadige nogen andre kirtler eller tarmene – hvis indhold kan cross-forurene prøve (trin 2.5, figur 4 og Figur 15). I optimal fald holdes efter udvinding af MGR indholdet, DG, samt VG synligt intakt (figur 4). Forureninger med indholdet af det generaldirektorat, som er placeret under MGRs, er svære at undgå helt. Årsager til dette kan også omfatte den delvise afbrydelse af kirtel integritet under transport på tøris fra prøvetagningsstedet til laboratoriet. Det er også muligt at GD’erne blive beskadiget under prøvetagningen eller er ved at eksplodere, som vi har bemærket for MGR i et antal undersøgte myrer. Da GD indholdet kan analyseres på samme måde som MGR indhold (afsnit 3 og 4), kan resultaterne sammenlignes med de resulterende data efter analyse af MGR indhold prøver (afsnit 6). For MGR indhold ekstrakter fremstillet af C. explodens myrer, begynder de forbindelser, der også findes i Generaldirektoratet at eluere sent i kromatogrammet (figur 12). At undgå fejl af GD forbindelser til MGR vælgere, de respektive metabolitter kan udelukkes fra yderligere analyse. Fra undersøgelser på andre myre arter er det kendt, at GD’er kan også indeholde (meget) flygtige forbindelser1,24, som typisk elueres tidligt i GC-kromatogram.
I tidligere undersøgelser beskæftiger sig med den kemiske sammensætning af MGR indholdet af COCY myrer, hele myrer eller deres hele gasters blev analyseret16,17,18,23, mens her MGR indhold selv blev indhentet via dissektion af myrer.
Analysere dissekeret MGR indholdet giver efterforskerne til at udføre en lang række biokemiske undersøgelser, herunder identifikation af metabolitter deri. Da den udførte undersøgelse her fokuseret på identifikation af de flygtige bestanddele i MGR af C. explodens, blev GC-MS valgt for sin analyse (afsnit 4). For dette, bør ekstrakterne ideelt målt umiddelbart efter tilberedning eller opbevares ved-80 ° C indtil analyse. Det skal bemærkes, at (udvidede) opbevaring kan forårsage kemiske ændringer af uddrag (Se noter efter trin 3.3 og 4.2). Da koncentrationen af MGR indholdet kan dække en række flere størrelsesordener, kan det være nødvendigt at analysere MGR uddrag på forskellige GC split nøgletal. Da de to primære forbindelser i MGR indhold uddrag af myrer at eksemplificere protokollen forårsaget kolonne overbelastning når split forholdet 2:1 blev brugt, var denne prøve analyseres en anden gang på et højere delingsforholdet af 50: 1 (trin 4.3.1.2and figur 5). GC-MS parameterindstillingerne præsenteret i afsnit 4 er velegnet til data genereret med GC-MS enheder angivet i Tabel af materialer. Ved siden af RI calibrants (trin 4.1.1), bør en opløsningsmiddel-tom (trin 4.1.2) også analyseres for at anerkende ikke-biologiske artefakter og forurenende stoffer under efterfølgende dataanalyser. For metabolitten identifikation er det også vigtigt at måle autentiske standarder af kommenteret forbindelser de samme GC-MS betingelser som bruges til at analysere prøveekstrakter (trin 5.4.7and følgende). For at forbedre nøjagtigheden og pålideligheden af de endelige data, anbefales det at analysere alle prøve kategorier (opløsningsmiddel-blank, RI calibrants, prøveekstrakter og standarder) inden for den samme måling sekvens. De autentiske standarder bør desuden analyseres ved en koncentration svarende til at der er konstateret for prøveekstrakter. Dette medvirker til at forbedre nøjagtigheden af RI værdier og lighed mellem prøve og standard massespektre, der endelig vil føre til øget og mere meningsfuld metabolit anmærkning/identifikation. Med henblik herpå, kan standarderne gentagne gange måles ved hjælp af forskellige split faktorer.
For metabolitten identifikation, den sofistikerede software, bruges MetaboliteDetector til spektre deconvolution og RI og spectra sammenligning med en implementeret NIST-bibliotek samt om et etableret biblioteket (afsnit 5). Det anbefales at køre MetaboliteDetector på en 64-bit LINUX-baseret operativsystem (fx KUBUNTU) og kopiere den genererede *. CDF-datafiler (trin 4.4) fra den bærbare datalagerenhed på den lokale harddisk. MetaboliteDetector er i stand til at importere GC-MS rådata i barycentrum eller profil netCDF format. Softwaren til de fleste GC-MS instrumenter bør være stand til at konvertere de registrerede rå data til dette format19. Før du starter dataanalyse, er det stærkt anbefales at læse litteratur tilgængelig for tidligere MetaboliteDetector softwareversioner at blive fortrolig med funktionerne og anskuelighed brugergrænseflade19,25, 26.
RI kalibrering og efterfølgende RI værdiberegning af de sammensatte toppe i prøveekstrakter bruges et bibliotek som indeholder RIs og spektre af RI calibrants (her, n-alkaner). Sådan et bibliotek kan enten være selvstændig etableret, eller en allerede eksisterende (‘CalibrationLibrary_Alkanes’) kan være hentet27. Det angivne standard-kalibratoren bibliotek indeholder RIs og spektre for n-alkaner spænder fra C09 til C39, som er blevet analyseret som beskrevet i afsnit 4. Det angivne bibliotek gør det muligt for brugere, der arbejder med metabolit detektor til direkte start med kalibreringen af deres data. Hvis det er nødvendigt, kan dette bibliotek også udvides med supplerende angivelser for yderligere alkaner. Baseret på lighed og eksperimentelt afledte RIs og massespektre (Se trin 5.3 og underordnede trin, figur 7, figur 8, fig. 9), kommentering eller identifikation af forbindelser kan være udført (trin 5.4 og underordnede trin, Figur 11). Det er også afgørende, at efter edb med MetaboliteDetector, brugeren vil manuelt kontrollere for korrekte peak plukning og spektrum deconvolution ved inspektion massespektre underliggende ‘trekant’ for hver formodede sammensatte af interesse. Desuden, afhængigt af GC-MS instrumentering og parameterindstillingerne bruges til data generation, tilpasninger af de præsenterede MetaboliteDetector indstillinger kan være nødvendigt. MetaboliteDetector software er i stand til at udføre mange flere nyttige handlinger end forklaret i dette manuskript, f.eks. visning af uddraget ion aktuelle (EIC) kromatogrammer, eksport af kromatogrammer som .csv, automatiske batch-kvantificering af forbindelser, og mange flere.
Protokollen præsenteret i dette håndskrift kan tjene som forslag til forsøg udført af andre forskere, at fokusere på isolering af kirtler eller kirtel indholdet fra insekter samt volatilome analyse og metabolitten identifikation.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering af denne undersøgelse blev opnået gennem Wien videnskab og teknologi Fund (WWTF) LS13-048 til ISD. Særlig tak til Diane W. Davidson (University of Utah, nu pensioneret) for at dele sin viden om Bornean COCY myrer med os. Vi sætter pris på forvaltninger af Kuala Belalong Field Studies Center (KBFSC) og Universiti Brunei Darussalam (UBD) for projektgodkendelse samt Brunei Forestry Department Bruneis forskning- og innovationscenter om tilladelse til at indsamle myrer og godkendelse og udstedelse af eksporttilladelser. Særlig tak til UBD og KBFSC personale, især Muhammad Salleh bin Abdullah Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan hage Mei, og Kushan Tennakoon for at lette vores forskning.
Tube 50 ml, 115 x 28 mm, flat/conical base PP | Sarstedt | 62,559,001 | see Figure 1 in manuscript |
PVC Tubings | Rehau | 290 4489 | see Figure 1 in manuscript |
Mesh, stainless steel, 0.63 mm mesh size | Antstore | 1000378 | see Figure 1 in manuscript |
Freezer | Severin | KS 9890 | -20 °C or lower |
polystyrene foam box, inner dimensions 155 mm x 100 mm x 45 mm | Thorsten Koch | 4260308590481 | |
Petri dish, glass, 100 mm x 15 mm | Aldrich | BR455742 | |
Cold pack 150 mm x 100 mm | Elite Bags | 1998 | freeze to -20 °C |
Bucket with crushed ice | |||
1.5 mL Short Thread Vials, 32 x 11.6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, wide opening | La-Pha-Pack | 11090500 | |
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, closed, Silicon white/PTFE red septum, 55° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151799 | |
Stereomicroscope | Bresser | 5806100 | |
Forceps, Superfine Tip curved | Medizinische Instrumente May, Norman May | PI-0005B | |
Forceps, Superfine Tip straight | blueINOX | BL-3408 | |
Dissection needle 140 mm, pointed, straight | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1110301 | |
Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Haën | fisher scientific | 15654740 | |
Distilled water | |||
Rotizell-Tissue-Tücher | Carl Roth GmbH + Co.KG | 0087.2 | |
Acetic acid ethyl ester ROTISOLV ≥99,8 % | Carl Roth GmbH + Co.KG | 4442.1 | freeze to -20 °C |
Vortex Genie 2 | neoLab | 7-0092 | |
0.1 mL micro-inserts for 1.5 mL Short Thread Vials, 31 x 6 mm, clear glass, 1st hydrolytic class, 15 mm tip | La-Pha-Pack | 06090357 | |
Screw caps for 1.5 mL Short Thread Vials, with hole, RedRubber/PTFE septum, 45° shore A, 1.0 mm | La-Pha-Pack | 9151819 | |
Alkane standard solution C8-C20 | Sigma-Aldrich | 04070 | |
Alkane standard solution C21-C40 | Sigma-Aldrich | 04071 | |
n-Hexane SupraSolv | Merck | 104371 | |
GC-autosampler, e.g. MPS2XL-Twister | Gerstel | ||
Agilent Gas chromatograph 6890 N | Agilent | ||
Gooseneck splitless Liner | Restek | 22406 | |
Helium (5.0 – F50) | Messer | 102532501 | |
GC capillary column HP-5MS UI 30 m × 0.25 mm ×0.25 µm | Agilent | 19091S-433UI | |
Agilent Mass Selective Detector 5975B | Agilent | ||
MSD ChemStation Data Analysis Application software | Agilent | ||
MetaboliteDetector software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux) | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
Calibration Library for MetaboliteDetector | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 | |
MD Conversion Tool for NIST-library | Hiller K | download from: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10 |