Karakteristikk av akvatiske biofilm med flowcytometri

Summary

Flowcytometri i kombinasjon med visuelle klynger tilbyr en enkel å bruke og rask metode for å studere vannplanter biofilm. Den kan brukes for biofilm karakterisering, gjenkjenning av endringer i biofilm samfunnet struktur og gjenkjenning av abiotiske partikler i biofilm.

Abstract

Biofilm er dynamisk konsortier av microorganism som spiller en viktig rolle i ferskvann økosystemer. Ved å endre samfunnet strukturen, biofilm respons rask til endringer i miljøet, og dermed kan brukes som indikatorer på vannkvalitet. Foreløpig er biofilm vurdering hovedsakelig basert på integrerende og funksjonelle sluttpunkter, som fotosynteseaktiviteten eller luftveiene aktivitet, som ikke gir informasjon på biofilm samfunnet strukturen. Flowcytometri og beregningsorientert visualisering tilbyr en alternativ, følsom og lett-å-bruke metode for vurdering av samfunnet sammensetningen, spesielt i den photoautotrophic delen av ferskvann biofilm. Det krever bare grunnleggende eksempel forberedelse, hvoretter hele prøven kjøres gjennom flyt-cytometer. Informasjon om encellede optisk og fluorescerende brukes for beregningsorientert visualisering og biologiske tolkning. De viktigste fordelene over andre metoder er analyse og høy-informasjon innhold natur. Flowcytometri inneholder informasjon om flere mobilnettet og biofilm egenskaper i et enkelt mål: partikkelstørrelse, tetthet, pigment innhold, abiotiske innhold i biofilm og grov taksonomisk informasjon. Men gir det ikke informasjon på biofilm komposisjon på arter nivå. Vi ser stort potensiale i bruk av metoden for miljøovervåking til akvatiske økosystemer og som en innledende biofilm evaluering trinn som informerer nedstrøms detaljerte undersøkelser av komplementære og mer.

Introduction

Biofilm er dynamisk konsortier av microorganism som spiller en nøkkelrolle i ferskvann økosystemer, oppstiller fra primærproduksjon, Nærings sykling og vannrensing å påvirke fordelingen av mikroorganismer og deres biologisk mangfold i økosystemet ¹. Når biofilm er utsatt på endrede miljøforhold eller stressorer, som kjemikalier, samfunnet strukturen raskt Skift mot mer tolerante arter^2,3. Deres høy følsomhet blir biofilm attraktive modellsystemer for miljømessige overvåking⁴, men ingen av gjeldende metoder er perfekt egnet til å spore faktisk dynamiske av en biofilm samfunnet på en rask og enkel måte.

Brukte settet med metoder å karakterisere biofilm består av måling av funksjonelle og strukturelle endepunktene. På nivå med hele samfunnet gir fotosynteseaktiviteten og luftveiene aktivitet som aktiviteten til ekstracellulære enzymer informasjon om funksjonelle tilstanden av biofilm^{5,6,7,8 ,9}. Biomasse belastning brukes som en indikator for samlet biofilm vekst. Strukturelle endringer er foreløpig målt enten ved hjelp av tradisjonelle arter identifikasjon med * lys eller nukleotid-baserte teknikker (f.eksdenaturing gradient gel geleelektroforese (DGGE), automatisert ribosomal intergenisk spacer analyse (ARISA), metagenomics)^10,11,12. Disse metodene informasjon men er tidkrevende å utføre, eller krever spesifikk kunnskap, eller er fortsatt under utvikling. Endelig nye metoder for vurdering av den ekstracellulære polymere stoffer (EPS)^13,14 og biofilm arkitektur¹, mens følsom, er lav gjennomstrømming og har ennå ikke utviklet mot overvåking formål.

Det er tydelig at for komplett karakteristikk av ferskvann biofilm, er det nødvendig å kombinere flere forskjellige metoder, som gir innsikt i biofilm funksjon, komposisjon og arkitektur. For miljøovervåking, derimot, kreves en rask og følsom metode som kan registrere endringer i biofilm og aktiverer grunnleggende biologisk tolkning av endringer på funksjonelle og strukturelle.

Vi har utviklet en ny metode for mikrobiell samfunnet karakterisering av phototrophic komponenten av strømmen biofilm (periphyton), som er rask nok for overvåking formål, og samtidig gir tilstrekkelig informasjon om biofilm samfunnet struktur slik at biologiske tolkning¹⁵. Den er basert på én celle flowcytometri (FC) av biofilm prøver og kombinert med beregningsorientert visualisering og gir informasjon om optisk og fluorescerende egenskaper biofilm på enkeltcelle nivå.

Arbeidsflyten etter biofilm utvalg består av prøven forberedelse i form av sonication, fiksering og -basert filtrering av prøvene etterfulgt av vurdere utvalget av flowcytometri. Ervervet dataene gir informasjon om flere mobilnettet egenskaper i et enkelt mål: partikkelstørrelse, tetthet, pigment innhold, abiotiske innhold (f.eks microplastics) i biofilm. Disse dataene er analysert via beregningsorientert visualisering ved hjelp av visuelle Stokastisk nabo innebygging (viSNE)¹⁶, som gir rask og enkel tolkning av dataene. Selv om noen uker kreves for å konfigurere og optimalisere metoden når satt opp, det tar bare et par timer fra samle biofilm prøvene å tolke resultatene.

De viktigste fordelene med metoden presentert over andre er analyse og høy-informasjon innhold. Videre kan prøvene lagres i flere uker etter samling uten tap av deres optisk og fluorescens egenskaper. Dette kan være veldig nyttig når karakteristikk av en rekke prøver kreves, for eksempel store prøvetaking studier eller biomonitoring programmer, men kan også gi en betydelig mengde informasjon i mindre utforskende studier.

Presentert protokollen er basert på flyt-cytometric analyse av phototrophic biofilm (periphyton) fra forskjellige steder i en strøm. Mange skritt av protokollen, f.eks valg av områder egnet for overvåking formål, avhenger av målene for forskningen og derfor ikke kan foreskrives. Andre gi mindre frihet og krever at protokollen følges nøye, dette er gjort klart i detaljert protokollen nedenfor.

Protokollen starter med valg av nettsteder for biofilm-baserte miljøovervåking. Neste skritt er å sette opp flyt-cytometer (FC) slik at dens mål aktiverer diskriminering mellom ulike phototrophic organismer som lever i biofilm i overvåkede miljøet. Dette utføres ved å samle biofilm prøver fra nettsteder, identifisere fluorescerende egenskapene til ulike arter til stede i biofilm og konfigurere flyt-cytometer med lasere og filtre som aktiverer måling på riktig optisk bølgelengder. Når FC er satt opp, biofilm kan være samlet fra områder med jevne mellomrom egenskapene optisk og fluorescerende enkelt partikler tilstede i biofilm målt ved flowcytometri, og dataene analysert av visuelle klynger. For bedre tolkning av resultatene er det mulig å bygge en FC referansedatabase med lokale biofilm-levende arter og deres fenotyper og bruke databasen for å identifisere ulike taksonomier i FC data. Validering er mulig gjennom fluorescens-basert sortering av de identifiserte klyngene av enkeltceller FACS og mikroskopi-baserte taksonomisk identifikasjon av nåværende arter. En skjematisk av protokollen som er angitt i figur 1.

Protocol

1. økosystem utvalg og Biofilm prøvetaking Velg en akvatisk økosystem rundt og finne målestasjoner hvor biofilm vokse. Grunne delene av en strøm med treg til middels vannføring og en steinete streambed biofilm feste er riktig17,18. Valgfritt: Hvis området ikke har nok flater biofilm feste, eller redusere biofilm variasjon innen et område, plassere kunstig substrater for biofilm vedlegg (f.eks glass lysbilder, keramiske fliser)…

Representative Results

Bruke fremgangsmåten presenteres her (figur 1), ble prøver tatt fra flere steder av en lokal strøm i Sveits analysert. Tre lignende størrelse steiner (10-12 cm) ble tatt på hvert område, og biofilm var børstet av steinene. Prøvene var så sonicated, fast, filtrert og senere analysert av flowcytometri. Oppsettet av flyt cytometer og referanse databasen brukes var de samme som beskrevet i en tidligere papir15: tre lasere ble bruk…

Discussion

Protokollen beskrevet ovenfor er relativt enkel å implementere. Men mens presentert standardinnstillingene har vist seg å være egnet for alle phototrophic biofilm testet hittil, er optimalisering (som beskrevet i protokollen) nødvendig å maksimere informasjonen fra metoden. Faktisk kan egenskapene optisk og fluorescerende biofilm variere, avhengig av miljømessige forhold (sesong, temperatur, kjemisk sammensetning av vann)¹. Derfor er det viktig å ta hensyn til dette variasjon når FC analys…

Materials

Multimeter	WTW	MultiLine 3620 IDS	For measuring temperature, pH, dissolved oxygen
Ultrasonic cleaner	VWR International	97043-986	Tank dimesions: 15*14*10 cm
Flow cytometer	Beckman Coulter	Gallios	Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Plate reader	Tecan	Infinite M200	used for selecting appropriate setting of the FC
Cell sorter	Beckman Coulter	MoFlo Astrios	Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.
Fluorescence microscope	Zeiss	Axiovert 135	Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective
SOFTWARE
Matlab	MathWorks	R2013a	software for numerical computing
CYT	Dana Pe'er Lab	Version 1.1	free interactive visualization tool for analysis of cytometry data