Un método de preparación de muestra eficiente para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz
Summary
Se demuestra un protocolo para aumentar carbohidratos señales de iones en espectrometría de masas MALDI por reformar estructuras cristalinas durante los procesos de preparación de muestra.
Abstract
Preparación de la muestra es un proceso crítico en el análisis de espectrometría de masas (MS) de hidratos de carbono. Aunque la desorción/ionización del laser asistida por matriz (MALDI) MS es el método de elección en el análisis de hidratos de carbono, reproducibilidad de datos y señal pobre ion de muestras de hidratos de carbono siguen siendo problemas graves. Para el análisis cuantitativo de hidratos de carbono, es necesario un protocolo analítico eficaz proporcionando datos de superior calidad. Este video muestra los protocolos de preparación de muestra para mejorar la intensidad de la señal y minimizar la variación de datos de los carbohidratos en MALDI-MS. Después de secado y cristalización de las gotas de la muestra, la morfología cristalina es reformada por el metanol antes de análisis de espectrometría de masa. La mejora en la señal de hidratos de carbono se examina con MALDI imaging espectrometría de masas (IMS). Resultados experimentales demuestran que la reforma de cristal ajusta estructuras cristalinas y redistribuye analitos de hidratos de carbono. En comparación con el método de preparación de gotas secas en MALDI-MS convencionales, reforma morfologías de cristal de hidratos de carbono con metanol muestra intensidad de señal significativamente mejor, ion imagen distribución y estabilidad de los datos. Puesto que los protocolos demostrados en este documento no implican cambios en la composición de la muestra, que son generalmente aplicables a diversos hidratos de carbono y matrices.
Introduction
Análisis de hidratos de carbono es un tema importante y desafiante. Hidratos de carbono y sus derivados desempeñan papeles importantes en vivir organismos1,2,3. Estas moléculas han complicado las estructuras y son propensas a descomponerse. Muchos de ellos no pueden ser claramente caracterizados debido a las dificultades en la separación y detección. Aunque láser asistida por matriz (MALDI) de desorción/ionización espectrometría de masas (MS) se ha aplicado al análisis de una amplia variedad de biomoléculas, debido a su sensibilidad y resultados comprensibles4, análisis de carbohidratos mediante MALDI-MS continúa para ser un gran desafío debido a la eficiencia de baja ionización de tales moléculas5. Derivatización química es una forma común para mejorar la eficiencia de la ionización de hidratos de carbono6,7, pero estos procedimientos son tiempo y consumo de la muestra. Además, la eficacia de la ionización de carbohidratos derivatizados es todavía más baja que la de las proteínas. Por lo tanto, es necesario el desarrollo de métodos para mejorar la señal de hidratos de carbono en MALDI-MS sin procedimientos complicados.
La aplicación del MALDI-MS para análisis cuantitativo es otro tema difícil. Un problema importante de MALDI-MS es que su sensibilidad y datos de reproducibilidad depende críticamente protocolos de preparación de muestra y parámetros experimentales. En muchos casos, análisis cuantitativo por MALDI-MS no es confiable debido a la morfología heterogénea muestra y distribución de analito. Un ejemplo bien conocido es muestras preparadas con la matriz MALDI (DHB) ácida 2, 5-dihydroxybenzoic. Cuando DHB se cristaliza lentamente bajo ambiente, el grado de incorporación de analito en cristales de la matriz es impredecible, ya que las muestras resultantes muestran morfologías irregulares. Dichas muestras normalmente consisten en grandes cristales aciculares y finos. Cuando DHB es preparado usando un disolvente volátil o una placa de la muestra calentada, un secado rápido resulta en cristales finos más homogéneos y mejor resultados cuantitativos8,9,10. Esta técnica se conoce como “recristalización” de muestras MALDI. La mejora se atribuye a la mejor incorporación de analitos en cristales finos matriz durante el proceso de cristalización rápida. También hemos demostrado que ajustar el ambiente de preparación de la muestra reduce la heterogeneidad de la señal de hidratos de carbono y mejores resultados cuantitativos11,12. Los resultados en estos trabajos sugieren que la morfología de la muestra es un factor crítico en la determinación de calidad de la señal de hidratos de carbono. Para desarrollar una estrategia general para el análisis diario, se requiere un método de reforma muestra eficiente proporcionando carbohidratos mayor sensibilidad.
Sistemáticamente hemos examinado la correlación entre la sensibilidad morfología y carbohidratos muestra en MALDI-MS en un reciente informe13. Los resultados obtenidos utilizando varios carbohidratos importantes y mostrar matrices que el mejor realce de la señal se ha cumplido por recristalización secado muestras MALDI. La morfología de muestras preparadas con el método de la gota seca convencional (DD) es reformada por recristalización rápida con metanol (MeOH). Los protocolos de preparación de la muestra detallada se demuestran aquí. El protocolo consta de tres pasos principales, incluyendo muestra placa preacondicionamiento, deposición de la muestra recristalización y análisis de espectrometría de masas. Los hidratos de carbono utilizados incluyen sialil-lewis (SLeA) y maltoheptaose (MH). DHB se utiliza como una matriz de modelo. Los resultados muestran que los carbohidratos señal intensidad y distribución espacial mejoraron marcado después de la recristalización. Este método puede aplicarse a muestras con otras matrices populares, 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) y α– ciano-4-hidroxicinámico el ácido. Este método sirve como un enfoque general que se puede integrar fácilmente en la rutina de laboratorio para el análisis de hidratos de carbono.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heterogeneidad de la muestra es que un problema crucial en MALDI-Sra. DD es el más comúnmente utilizado método de preparación de la muestra, pero los cristales resultantes son altamente heterogéneos. Dichas muestras demostración reproductibilidad pobre señal de tiro a tiro y muestra a muestra. Por lo tanto, buscar “puntos” en áreas de la muestra durante la adquisición de datos es un procedimiento común en los experimentos MALDI. Dichas muestras heterogéneas no son adecuadas para la cuantificación en análisis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores no tienen ninguna agradecimientos.
Materials
| Reagent | |||
| Detergent powder | Alconox | 242985 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Acetonitrile | Merck | 100003 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) | Alfa Aesar | A11459 | |
| sialyl-lewis A (SLeA) | Sigma-Aldrich | S1782 | |
| Maltoheptaose | Sigma-Aldrich | M7753 | |
| Pipette tips | Mettler Toledo | 17005091 | |
| Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| Equipment | |||
| Milli-Q water purification system | Millipore | ZMQS6VFT1 | |
| Powder-free nitrile gloves | Microflex | SU-690 | |
| 600 mL beaker | Duran | 2110648 | |
| Ultrasonic cleaner | Delta | DC300H | |
| Hygrometer | Wisewind | 5330 | |
| Nitrogen gas flowmeter | Dwyer | RMA-6-SSV | |
| K-type thermocouples | Digitron | 311-1670 | |
| Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Mini centrifuge | Select BioProducts | Force Mini | |
| Pipette | Rainin | pipet-lite XLS | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Temperature controllable drying chamber | This lab | ||
| Ultraflex II TOF/TOF mass spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| MTP 384 target plate polished steel BC | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Flexcontrol Version 3.4 | Bruker Daltonics | Control software | |
| Fleximaging Version 2.1 | Bruker Daltonics | Imaging software | |
| Flexanalysis Version 3.4 | Bruker Daltonics | Analysis software |
References
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