JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Published: May 03, 2018
doi:
10.3791/57674
, , ,
1Department of Chemistry,State University of New York at Binghamton

Summary

يتم تنشيط في مرحلة دورة الخلية G2 كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) وينظم العديد من المسارات الخلوية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة كيناز في المختبر مع Cdk1، مما يتيح تحديد المواقع الفسفرة Cdk1 على حدة لتحديد الأهداف الخلوية من هذا كيناز الهامة.

Abstract

كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) هو وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية في جميع حقيقيات النوى، وفوسفوريلاتيس ما يقدر 8-13 ٪ من البروتين؛ ومع ذلك، العدد الأهداف المحددة ل Cdk1، لا سيما في الخلايا البشرية لا يزال منخفضا. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة المهم، كما أنها توفر الميكانيكية ثاقبة كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية. تنظيم دورة الخلية أمر حاسم للعزل الصبغي المؤمنين، والعيوب في هذه العملية المعقدة تؤدي إلى الكروموزومي والسرطان.

هنا، يمكننا وصف في المختبر كيناز مقايسة المستخدمة لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة. في هذا التحليل، بروتين المنقي فوسفوريلاتيد في المختبر بنجاح ب Cdk1/cyclin البشرية المتاحة تجارياً الفسفرة ما يؤكده الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، ويتم فيما بعد تحديد مواقع الفسفرة من الطيف الكتلي. ونحن أيضا وصف تنقية البروتوكولات التي تسفر عن الاستعدادات البروتين عالية نقية ومتجانسة مناسبة للمقايسة كيناز، ومقايسة ملزمة التحقق الوظيفية للمواقع المحددة الفسفرة، الذي يسبر التفاعل بين إشارة تعريب نووية كلاسيكية (أدى) وبه α كاريوفيرين مستقبلات النقل النووي. للمساعدة مع التصميم التجريبي، نقوم بمراجعة النهج للتنبؤ بمواقع الفسفرة Cdk1 محددة من تسلسل البروتين. معا هذه البروتوكولات الحالية اتباع نهج قوية جداً غلة مواقع الفسفرة Cdk1 محددة وتمكن الدراسات الميكانيكية في كيفية Cdk1 يتحكم في دورة الخلية. حيث يعتمد هذا الأسلوب على البروتينات المنقاة، يمكن تطبيقها على أي نموذج الكائن الحي وغلة نتائج يمكن الاعتماد عليها، خاصة عندما تقترن بخلية الدراسات الفنية.

Introduction

مؤنزم هي الإنزيمات التي نقل مجموعات الفوسفات من ATP على ركائز وتنظيم العديد من العمليات الخلوية. هذا الفسفرة يتم عكسها وسريع، يضيف تهمتين تتعلقان بالسلبية، ويخزن الطاقة الحرة وهو واحد من التعديلات بوسترانسلاشونال الأكثر شيوعاً المستخدمة من قبل الخلايا. Cdk1، ويعرف أيضا باسم دورة انقسام الخلية البروتين 2 هومولوج (cdc2) وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية في جميع حقيقيات النوى1،2،3،،من45، وفوسفوريلاتيس ما يقدر 8-13 ٪ من البروتين6،7.

في حين حددت الدراسات البروتين مؤخرا العديد من المواقع الفسفرة في البروتينات، في معظم الحالات، كيناز المسؤولة عن هذه التعديلات غير معروف. هو عدد أهداف Cdk1 المعروفة، لا سيما في الخلايا البشرية منخفضة7. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة المهم، كما أنها تمكن الدراسات الميكانيكية التي تحدد كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية. تنظيم دورة الخلية مهم للعزل الصبغي المؤمنين وانقسام الخلية، وتحتاج إلى عدد هائل عمليات الخلوية تحدث لدعم هذه الوظيفة الفسيولوجية الهامة. وهذا يشمل وقف النسخ والترجمة قبل ظهور الانقسام، فضلا عن إعادة تنظيم هائلة في البنية الخلوية والمنظمة، مثل التفكيك النووي المغلف والتكثيف كروموسوم، والجمعية المغزل التفتلي. التحرر من القيود والأخطاء في هذه العمليات تسبب السرطان أو العيوب الخلقية أو موت الخلية الانقسامية. كانت مثبطات محددة من Cdk1 مثل رو-33068من البلدان المتقدمة النمو، التي توفر أدوات قوية للدراسات الفنية، وبعض من هذه الموانع حاليا في التجارب السريرية لعلاج السرطان (انظر9 للاستعراض).

هنا، يمكننا وصف في المختبر كيناز مقايسة التي تتيح تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة. في هذا التحليل، يستخدم ب Cdk1/cyclin البشرية المتاحة تجارياً فوسفوريلاتي هدف تنقية بروتين في المختبر. الفسفرة الركازة يزيد وزنها ويضيف تهمتين تتعلقان بالسلبية؛ ولذلك، يؤكد الفسفرة ناجحة تحول صاعد من الفرقة جل البروتين على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. يتم تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة فيما بعد بتحليل الطيف الكتلي للبروتين في المختبر فوسفوريلاتيد. للمعونة مع التصميم التجريبي، نحن أيضا مراجعة الأدوات الحاسوبية ومراجع للتنبؤ بمواقع الفسفرة Cdk1 محددة من تسلسل البروتين. وعلاوة على ذلك، نحن أيضا وصف تنقية البروتوكولات التي تسفر عن البروتين عالية نقية ومتجانسة استعدادات مناسبة للمقايسة كيناز. وأخيراً، يجب التحقق من المواقع التي تم تحديدها الفسفرة بالدراسات الفنية، ومقايسة ربط بسيط يرد هنا لهذا الغرض. جنبا إلى جنب، هذا هو نهج قوية جداً غلة مواقع الفسفرة Cdk1 محددة وتمكن الدراسات الميكانيكية في كيف يتحكم Cdk110،،من711دورة الخلية. حيث يعتمد هذا الأسلوب على البروتينات المنقاة، فإنه يمكن تطبيقها على أي نموذج الكائن الحي وغلة نتائج يمكن الاعتماد عليها. مع ذلك، ينصح التحقق الوظيفية الفسفرة الحصول على مواقع في المختبر ، الخلايا لديها آليات تنظيمية إضافية في المكان، مثل التعديلات بوستترانسلاشونال أو الشركاء التفاعل التعريب الخلوية التي قد تجعل المواقع الفسفرة موجوداً أو لا يمكن الوصول إليها للاعتراف بواسطة Cdk1.

تسلم Cdk1 موقع الفسفرة توافق آراء الذي يتكون من (Ser/Thr-برو-X-ليز/Arg)، حيث X أي بقايا وأن سيرين أو ثريونين هو موقع الفسفرة. وأهمية خاصة للاعتراف بوجود برولين في الموقف + 1. وبالإضافة إلى ذلك، يفضل مخلفات الأساسية في المواقف + 2 أو + 3، مع معظم المواقع الفسفرة Cdk1 محددة تحتوي على Lys أو الأرجنتين في + 3 وضع6،12.

أحكام تنظم تفعيل Cdk1 ويؤدي إلى ظهور الانقسام1،2،3،،من45. نشاط مؤنزم cyclin تعتمد على بشكل عام يعتمد على ارتباطها مع متميزة سيكلينس (cyclin أ ب، ج، د والإلكترونية في البشر)، التي يتم التعبير عنها في تذبذب مستويات طوال دورة الخلية13. Cdk1 التعبير ثابت عبر دورة الخلية وتنظيم نشاطها يعتمد على ارتباطه بالوحدات الفرعية التنظيمية cyclin A و cyclin ب5،13،،من1415، كما فضلا عن تعديلات بوستترانسلاشونال. تشكيل المجمع ب Cdk1/cyclin مطلوب من أجل التنشيط كيناز5،15،،من1416،،من1718. في المرحلة G2، ترجم في سيتوسول ب cyclin واستيرادها إلى نواة حيث أنه يربط Cdk15،،من1415،16،،من1718؛ ومع ذلك، هو عقد ب Cdk1/cyclin المعطل الفسفرة في المخلفات Thr14 و Tyr15 مؤنزم المثبطة Cdk1 البشرية Myt1 (المرتبطة بغشاء تيروزين ثريونين محددة والمثبطة cdc2 كيناز) و Wee1، على التوالي19، ،من 2021. في أواخر المرحلة G2، ينشط نشاط المجمع ب Cdk1/cyclin كيناز ديفوسفوريليشن Thr14 و Tyr15 بدوره انقسام الخلية 25 الفوسفاتيز (cdc25) ويقوم بتشغيل بدء الانقسام12،14، 18 , 20 , 22 , 23-الفسفرة Thr161 مطلوب أيضا للتنشيط ب Cdk1/cyclin وهو توسط Cdk7، Cdk-تفعيل كيناز (الكعكة)18. تدهور ب cyclin في طور الصعود يحللها Cdk1، مما يتيح الخروج من الانقسام24،25. ولتفعيل ب Cdk1/cyclin عملية معقدة. يتم تنفيذ البروتوكول المعروضة هنا مع المتاحة تجارياً ب Cdk1/cyclin خلال المؤتلف من التعبير عن هذا التعقيد في خلايا الحشرات، وهو المنشط في فيفو مؤنزم الذاتية14،20 وما زالت نشطة في الدولة النقية. الناتج النشط، المؤتلف البشرية Cdk1/cyclin ب مناسبة في المختبر فحوصات كيناز.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في السنترومير البشرية البروتين و (سينب-F)10. سينب-و هو بروتين كينيتوتشوري الذي يتواجد في النواة خلال الجزء الأكبر من الطور البيني (G1 و S-المرحلة) ويتم تصديره إلى سيتوسول في G2 المرحلة26،،من2728 في طريقة تعتمد على Cdk110، 11. التعريب النووية هو يمنحها أدى ثنائي26. يتم التعرف كنلس قبل α كاريوفيرين عامل النقل النووي، التي، جنبا إلى جنب مع β كاريوفيرين، ورانجدب، ويسهل استيراد البضائع أدى إلى نواة29. تصدير المواد النووية في مرحلة G2 يسر عبر مسار تصدير غير معروف10. بمجرد سينب إف تكمن في سيتوسول، يتم تجنيده للمغلف النووية والمجندين بدوره في30،دينين معقد البروتين السيارات31. هذا المسار هام لوضع نواة كل منها سينتروسومي خلال المراحل الأولية للجمعية المغزل التفتلي بطريقة تعتمد على دينين، هو أمر مهم للتوقيت الصحيح لدخول الانقسامية وعملية أساسية في الدماغ التنمية30،،من3132. بدءاً من مرحلة G2، سينب-و هو أيضا تجميعها في كينيتوتشوري حيث لديها أدوار هامة للمؤمنين كروموسوم الفصل27،،من2833،34،35 . خطوة تنظيمية أساسية من هذه المسارات يتم تصدير و سينب النووية في مرحلة G2، الذي يعتمد على10،Cdk111. يصف لنا هنا بروتوكولا لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في أدى من سينب-f. تبطئ الطفرات فوسفوميميتيك من هذه المواقع النووية استيراد سينب-F، مما يوحي بأن ب Cdk1/cyclin ينظم مباشرة التعريب الخلوية وسينب من الفسفرة من أدى10.

وعموما، هذا الإنزيم كيناز في المختبر يسمح تحديد ركائز محددة للبروتينات المستهدفة Cdk1. منقي كيناز فوسفوريلاتيد في المختبر بمجمع ب Cdk1/cyclin المتاحة تجارياً ومواقع الفسفرة وفي وقت لاحق حددها الكتلي. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة تدعم الدراسات الميكانيكية التي تكشف كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية.

Protocol

1-التنبؤ بمواقع محددة Cdk1 الفسفرة من تسلسل البروتين قبل بدء الفحص كيناز، تحليل تسلسل البروتين لتوقع مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة والبحث في الأدب لمواقع الفسفرة تجريبيا المنشأة مع خصوصية كيناز غير معروف. استخدم الأدوات التالية، وقواعد البيانات والمراجع التي يرد. استخدام iGPS 3.0 البرنام?…

Representative Results

أننا استخدمت مؤخرا في المختبر كيناز مقايسة (الشكل 1) لتحديد المواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في جزء سينب-و التي تحتوي على أدى10. يمنح هذا الإشارة التعريب النووية من سينب-و خلال الجزء الأكبر من الطور البيني. في المرحلة G2، يتم تصدير سينب إف من النوا…

Discussion

لدينا الإنزيم كيناز في المختبر هو وسيلة قوية جداً لتحديد أهداف جزيئية كيناز Cdk1، الذي هو وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية وينظم العديد من العمليات الخلوية الهامة. الأسلوب يحدد إذا كان بروتين المنقي هو ركيزة ل Cdk1، ويسمح لتحديد مواقع محددة الفسفرة. وهذا يسهل الدراسات الميكانيكية لتنظيم ال…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن نشكر الدكتور ديفيد كينغ، معهد هاوارد هيوز الطبي، جامعة كاليفورنيا في بيركلي لتحليل الطيف الكتلي وتعليقات مفيدة. ونحن نشكر الدكتور تشو شوليان، شانغهاي، معاهد “العلوم البيولوجية”، والأكاديمية الصينية للعلوم، شنغهاي، الصين لتوفير بنية سينب إف كاملة طول. وأخيراً، نشكر الدكتورة سوزان لعنة، والدكتور ريان كالاهان، والدكتور كريستوف جريوير في جامعة بنغهامتون للحصول على المعدات. تم تمويل هذا البحث من “مؤسسة البحوث” لجامعة ولاية نيويورك، وقسم الكيمياء، “الدولة جامعة نيويورك” في بنغهامتون.

Materials

2800 ml baffled Fernbach flask Corning 44232XL
ampicillin Gold Biotechnology A-301-25
ATP Fisher Scientfiic BP413-25
benzamidine hydrochloride Millipore Sigma B6506-25
bottletop filter Corning 431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL New England Biolabs P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source) EMD Millipore 14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source) Invitrogen PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer New England Biolabs P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor Thermo Scientific 10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes EMD Millipore UFC900324
chlorampenicol Gold Biotechnology C-105-100
D/L methionine Agros Organics / Fisher 125650010
desalting pipet tips: Zip tips Millipore Sigma ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm Biorad 7321010
dithiothreitol Gold Biotechnology DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain EMD Millipore 71403
electrospray ionization Fourier transform ion Bruker Amazon Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer Bruker Amazon custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy Thermo Scientific 97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC GE Healthcare 29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
glutathione agarose Pierce 16101
glutathione, reduced Millipore Sigma G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker Infors I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Gold Biotechnology I2481C50
kanamycin Gold Biotechnology K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid Available upon request.
Luria Bertani medium Fisher Scientfiic BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated Eppendorf 5401000013
microtubes (0.5 ml) Eppendorf 30121023
microtubes (1.5 ml) Eppendorf 30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel Millipore Sigma P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid Millipore Sigma GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride Gold Biotechnology P470-10
PS protease: PreScission protease GE Healthcare 27084301
Phos-tag acrylamide Wako Pure Chem. Ind. 304-93521
reduced gluthathione Millipore Sigma G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) Fisher Scientfiic 055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning Agilent 210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier Branson 15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) Spectrum Labs 08 670B
swing out rotor TX-1000 Thermo Scientific 10033-778
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
  2. Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31 (1987).
  3. Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85 (9), 3009-3013 (1988).
  4. Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54 (3), 433-439 (1988).
  5. Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60 (3), 487-494 (1990).
  6. Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425 (6960), 859-864 (2003).
  7. Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2448-2461 (2016).
  8. Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  9. Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22 (7), 2159-2164 (2016).
  10. Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16 (15), 1414-1429 (2017).
  11. Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33 (6), 703-716 (2015).
  12. Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4 (11), 973-982 (1994).
  13. Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15 (6), 122 (2014).
  14. Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12 (5), 1947-1954 (1993).
  15. Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7 (7), 903-916 (1996).
  16. Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13 (16), 3772-3781 (1994).
  17. Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131 (1995).
  18. Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -. E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25 (6), 839-850 (2007).
  19. Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92 (21), 9638-9642 (1995).
  20. Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13 (3), 1675-1685 (1993).
  21. Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17 (2), 571-583 (1997).
  22. McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12 (1), 75-85 (1993).
  23. Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242 (1991).
  24. Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786 (1), 49-59 (2008).
  25. Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119 (12), 2401-2404 (2006).
  26. Zhu, X., Chang, K. -. H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -. H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270 (33), 19545-19550 (1995).
  27. Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130 (3), 507-518 (1995).
  28. Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26 (3), 214-226 (1993).
  29. Christie, M., Chang, C. -. W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428 (10A), 2060-2090 (2016).
  30. Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
  31. Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192 (5), 855-871 (2011).
  32. Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154 (6), 1300-1313 (2013).
  33. Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17 (13), 1173-1179 (2007).
  34. Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13 (4), 275-283 (2003).
  35. Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25 (10), 4062-4074 (2005).
  36. Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1598-1608 (2008).
  37. Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11 (10), 1070-1083 (2012).
  38. UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D158-D169 (2017).
  39. Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3 (104), ra3 (2010).
  40. Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105 (31), 10762-10767 (2008).
  41. Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69 (12), 2495-2505 (2013).
  42. Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279 (20), 20613-20621 (2004).
  43. Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10171-10176 (2009).
  44. McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 591-602 (2001).
  45. Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62 (13), 1284-1295 (1990).
  46. Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281 (33), 23545-23556 (2006).
  47. Hong, K. U., Kim, H. -. J., Kim, H. -. S., Seong, Y. -. S., Hong, K. -. M., Bae, C. -. D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284 (24), 16501-16512 (2009).
  48. Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88 (1999).
  49. Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  50. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  51. Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (18), 2075-2081 (2003).
  52. Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43 (2), (2017).
  53. Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7 (22), 3556-3563 (2008).
  54. Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (3), 608-613 (2006).
  55. Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276 (24), 20913-20923 (2001).
  56. Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274 (46), 32631-32637 (1999).

Tags

CDK1PhosphorylationKinase AssayCell CycleCENP-FProtein ExpressionE. ColiLB MediumAntibioticsProtein Purification
check_url/57674?article_type=t&slug=identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay. J. Vis. Exp. (135), e57674, doi:10.3791/57674 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image