JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Published: May 03, 2018
doi:
10.3791/57674
, , ,
1Department of Chemistry,State University of New York at Binghamton

Summary

Cyclin-avhengige kinase 1 (Cdk1) er aktivert i G2 fase av cellen syklus og regulerer mange mobilnettet baner. Her presenterer vi en protokoll for i vitro kinase analysen med Cdk1, som gjør identifisering av Cdk1-spesifikke fosforylering områder for å etablere mobilnettet mål for denne viktige kinase.

Abstract

Cyclin-avhengige kinase 1 (Cdk1) er en mester kontroller for cellen syklusen i alle eukaryoter og phosphorylates anslagsvis 8-13% av proteom; men er antall identifiserte mål for Cdk1, spesielt i menneskeceller fortsatt lav. Identifikasjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder er viktig som de gir mekanistisk innsikt i hvordan Cdk1 styrer cellen syklus. Cellen syklus regulering er avgjørende for trofast kromosom segregering mangler i denne kompliserte prosessen fører til chromosomal avvik og kreft.

Her beskriver vi en i vitro kinase analyse som brukes til å identifisere Cdk1-spesifikke fosforylering områder. I denne analysen, en renset protein er fosforylert i vitro av kommersielt tilgjengelige menneskelige Cdk1/cyclin B. vellykket fosforylering er bekreftet av SDS side og fosforylering nettsteder identifiseres senere massespektrometri. Vi beskriver også rensing protokoller som gir svært ren og homogen protein forberedelser for kinase analysen, og en bindende analysen identifiserte fosforylering nettsteder, som sonder samspillet mellom funksjonell bekreftes et klassisk kjernefysiske lokalisering signal (cNLS) og dens kjernefysiske transport reseptoren karyopherin α. For å hjelpe med eksperimentell design, vi går gjennom metoder for prediksjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder fra protein sekvenser. Sammen gir disse protokollene en svært kraftig metode som gir Cdk1-spesifikke fosforylering områder og aktiverer mekanistisk studier i hvordan Cdk1 styrer cellen syklus. Siden denne metoden er avhengig av renset proteiner, kan den brukes på modellen organismen og gir pålitelig resultat, spesielt kombinert med cellen funksjonelle studier.

Introduction

Kinaser er enzymer som overføre fosfat grupper fra ATP på underlag og regulere mange cellulære prosesser. Denne fosforylering reversibel, rask, legger to negative kostnader, og lagrer fri energi og er en av de vanligste posttranslational modifikasjonene brukes av celler. Cdk1, som kalles også cellen divisjon syklus protein 2 homolog (cdc2) er en mester kontroller for cellen syklusen i alle eukaryoter1,2,3,4,5, og phosphorylates en anslagsvis 8-13% av proteom6,7.

Mens proteomic studier har identifisert mange fosforylering nettsteder i proteiner, oftest er kinase ansvarlig for disse endringene ukjent. Antall kjente Cdk1 mål, spesielt i menneskeceller er lav7. Identifikasjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder er viktig, ettersom mekanistisk studier som etablerer hvordan Cdk1 styrer cellen syklus. Cellen syklus regulering er viktig for trofast kromosom segregering og celledeling, og et mylder av cellulære prosesser må skje for å støtte denne viktige fysiologiske funksjon. Dette inkluderer stanse transkripsjon og oversettelse før utbruddet av mitose, samt en dramatisk omorganisering i cellestruktur og organisasjon, for eksempel demontering av kjernefysiske konvolutten, kromosom kondens og mitotisk spindelen montering. Dereguleringen og feil i prosessene føre til kreft, fødsel defekter eller mitotisk celledød. Bestemt hemmere av Cdk1 som RO-3306 var utviklet8, som gir kraftige verktøy for funksjonell studier, og noen av disse hemmere finnes i kliniske studier for kreftbehandling (se9 for gjennomgang).

Her beskriver vi i vitro kinase analysen som gjør identifisering av Cdk1-spesifikke fosforylering områder. I denne analysen, tilgjengelige menneskelige Cdk1/cyclin B til å phosphorylate en renset målet protein i vitro. Fosforylering av et øker sin masse og legger to negative kostnader; Derfor er vellykket fosforylering bekreftet av et skift oppover i protein gel bandet på SDS-siden. Cdk1-spesifikk fosforylering nettsteder identifiseres senere massespektrometri analyse av proteinet i vitro fosforylert. For å hjelpe med eksperimentell design, se vi også beregningsorientert verktøy og referanser for prediksjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder fra protein sekvensen. I tillegg beskriver vi også rensing protokoller som gir svært rent og homogen protein forberedelser egnet for kinase analysen. Endelig identifisert fosforylering nettstedene må verifiseres av funksjonelle studier, og en enkel binding analysen er beskrevet her for dette formålet. Kombinert, er dette en svært kraftig tilnærming som gir Cdk1-spesifikke fosforylering områder og aktiverer mekanistisk studier i hvordan Cdk1 styrer celle syklus7,10,11. Siden denne metoden er avhengig av renset proteiner, kan det brukes på alle modell organismen og gir pålitelige resultater. Men funksjonell bekreftelse for innhentet fosforylering nettsteder vitro anbefales celler har ytterligere regulatoriske mekanismer sted, for eksempel posttranslational modifikasjoner, samhandling partnere eller mobilnettet lokalisering som kan gjøre fosforylering nettsteder tilgjengelige eller utilgjengelige for anerkjennelse av Cdk1.

Cdk1 gjenkjenner en konsensus fosforylering område som består av (Ser/Thr-Pro-X-Lys/Arg), der X er noen rester og en serine eller threonin er stedet for fosforylering. Spesielt viktig for anerkjennelse er tilstedeværelsen av proline i posisjon 1. I tillegg grunnleggende rester er foretrukket i 2 eller 3 posisjoner, med de fleste Cdk1-spesifikke fosforylering områder som inneholder et Lys eller Arg på 3 posisjon6,12.

Aktivering av Cdk1 er strengt regulert og fører til utbruddet av mitose,1,,2,,3,,4,,5. Aktiviteten til cyclin-avhengige kinaser er generelt avhengig av tilknytningen forskjellige cyclins (cyclin A, B, C, D og E hos mennesker), som er uttrykt ved oscillerende nivåer gjennom cellen syklus13. Cdk1 uttrykk er konstant over cellen syklus og regulering av sin aktivitet er avhengig av tilknytningen til de regulatoriske underenheter cyclin A og cyclin B5,13,14,15, som samt post-translasjonell endringer. Dannelse av Cdk1/cyclin B komplekset er nødvendig for kinase aktivisering5,14,15,16,17,18. Den G2 fasen, er cyclin B oversatt i stoffer og importert til kjernen der det binder seg til Cdk15,14,15,16,17,18; men holdes Cdk1/cyclin B deaktivert ved fosforylering på rester Thr14 og Tyr15 av de menneskelige Cdk1-hemmende kinaser Myt1 (membran-assosiert tyrosin – og threonin-spesifikk cdc2-hemmende kinase) og Wee1, henholdsvis19, 20,21. I slutten G2 fase, dephosphorylation Thr14 og Tyr15 av cellen divisjon syklus 25 fosfatase (cdc25) aktiverer kinase aktiviteten til Cdk1/cyclin B-komplekset og utløser initiering av mitose12,14, 18 , 20 , 22 , 23. fosforylering i Thr161 er også nødvendig for Cdk1/cyclin B aktivisering og er formidlet av Cdk7, Cdk-aktivere kinase (CAK)18. Nedbrytning av cyclin B i anaphase deaktiverer Cdk1, slik at exit fra mitose24,25. Aktivering av Cdk1/cyclin B er derfor en komplisert prosess. Protokollen presenteres her er utført med kommersielt tilgjengelige Cdk1/cyclin B. Under rekombinant uttrykk for dette komplekset i insekt celler, det er aktivert i vivo av endogene kinaser14,20 og forblir aktiv i renset staten. Den resulterende aktive, rekombinant menneskelige Cdk1/cyclin B er egnet for i vitro kinase analyser.

Her beskriver vi en protokoll for identifisering av Cdk1-spesifikke fosforylering områder i menneskelig centromere protein F (CENP-F)10. CENP-F er en kinetochore protein som finnes i kjernen under mesteparten av interphase (G1 og S-fase) og eksporteres til stoffer i G2 fase26,27,28 i en Cdk1-avhengige måte10, 11. kjernefysiske lokalisering er gitt av en bipartite cNLS26. cNLSs gjenkjennes av kjernefysiske transport faktor karyopherin α, som letter, karyopherin β og RanGDP, import av cNLS-Last i kjernen29. Kjernefysisk eksport i G2 fase muliggjøres via en ukjent eksport veien10. Når CENP-F ligger i stoffer, det er rekruttert til den kjernefysiske konvolutten og rekrutterer igjen motor protein kompleks dynein30,31. Denne veien er viktig å plassere kjernen respektive til centrosome under innledende stadier av mitotisk spindelen montering i en dynein-avhengige måte, som er viktig for riktig tidspunkt mitotisk posten og en grunnleggende prosess i hjernen utvikling30,31,32. Starter i G2 fase, er CENP-F også samlet inn i kinetochore der det er viktige roller for trofast kromosom segregering27,28,33,34,35 . Et viktige forskrifter skritt av disse er kjernefysiske eksport av CENP-F i G2 fase, som er avhengig av Cdk110,11. Vi beskriver her en protokoll for identifisering av Cdk1-spesifikke fosforylering områder i cNLS av CENP-F. Phosphomimetic mutasjoner av disse nettstedene tregere kjernefysiske import av CENP-F, antyder at Cdk1/cyclin B direkte regulerer mobilnettet lokalisering av CENP-F ved fosforylering i sin cNLS10.

Samlet gjør denne i vitro kinase analysen identifikasjon av bestemte underlag for kinase Cdk1. Purified målet proteiner er fosforylert i vitro kommersielt tilgjengelige Cdk1/cyclin B komplekset og webområdene fosforylering identifiseres senere av massespektrometri. Identifikasjon av Cdk1-spesifikke fosforylering områder støtter mekanistisk studier som viser hvordan Cdk1 styrer cellen syklus.

Protocol

1. prediksjon av Cdk1-spesifikke fosforylering nettsteder fra Protein sekvensen Før analysen kinase, analysere protein sekvens for predikerte Cdk1-spesifikke fosforylering områder og søke litteraturen for eksperimentelt etablerte fosforylering nettsteder med ukjent kinase spesifisitet. Bruk av følgende verktøy, databaser og referanser som summeres. Bruke IGPer 3.0 programvare36,37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) for å forutsi Cd…

Representative Results

Vi har nylig brukt i vitro kinase analysen (figur 1) til å identifisere Cdk1-spesifikke fosforylering områder i et CENP-F-fragment som inneholdt en cNLS10. Dette signalet gir kjernefysiske lokalisering av CENP-F under mesteparten av interphase. I G2 fase eksporteres CENP-F fra kjernen til stoffer i en Cdk1-avhengige måte. For å få mekanistisk innsikt i hvordan Cdk1 regulerer mobilnettet lokalisering av CENP-F, analysert v…

Discussion

Våre i vitro kinase analysen er en meget kraftfull metode å identifisere molekylære mål for kinase Cdk1, som er en master kontroller av cellen syklus og regulerer mange viktige cellulære prosesser. Metoden bestemmer hvis en renset protein er et medium for Cdk1 og lar identifikasjon av bestemte fosforylering nettsteder. Dette forenkler mekanistisk studier for regulering av cellulære prosesser ved fosforylering gjennom Cdk1.

Den mest kritiske faktoren for vellykket identifikasjon …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Dr. David King, Howard Hughes Medical Institute, University of California i Berkeley for massespektrometri analyse og nyttige kommentarer. Vi takker Dr. Xuelian Zhu, Shanghai, institutter for biologiske basalfag, kinesiske vitenskapsakademi, Shanghai, Kina for å gi en full lengde CENP-F-konstruksjon. Til slutt, vi takker Dr. Susan Bane, Dr. Brian Callahan og Dr. Christof Grewer ved Binghamton University for tilgang til utstyr. Denne forskningen ble finansiert av Research Foundation for State University of New York og ved Institutt for kjemi, State University of New York på Binghamton.

Materials

2800 ml baffled Fernbach flask Corning 44232XL
ampicillin Gold Biotechnology A-301-25
ATP Fisher Scientfiic BP413-25
benzamidine hydrochloride Millipore Sigma B6506-25
bottletop filter Corning 431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL New England Biolabs P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source) EMD Millipore 14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source) Invitrogen PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer New England Biolabs P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor Thermo Scientific 10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes EMD Millipore UFC900324
chlorampenicol Gold Biotechnology C-105-100
D/L methionine Agros Organics / Fisher 125650010
desalting pipet tips: Zip tips Millipore Sigma ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm Biorad 7321010
dithiothreitol Gold Biotechnology DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain EMD Millipore 71403
electrospray ionization Fourier transform ion Bruker Amazon Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer Bruker Amazon custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy Thermo Scientific 97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC GE Healthcare 29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
glutathione agarose Pierce 16101
glutathione, reduced Millipore Sigma G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker Infors I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Gold Biotechnology I2481C50
kanamycin Gold Biotechnology K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid Available upon request.
Luria Bertani medium Fisher Scientfiic BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated Eppendorf 5401000013
microtubes (0.5 ml) Eppendorf 30121023
microtubes (1.5 ml) Eppendorf 30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel Millipore Sigma P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid Millipore Sigma GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride Gold Biotechnology P470-10
PS protease: PreScission protease GE Healthcare 27084301
Phos-tag acrylamide Wako Pure Chem. Ind. 304-93521
reduced gluthathione Millipore Sigma G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) Fisher Scientfiic 055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning Agilent 210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier Branson 15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) Spectrum Labs 08 670B
swing out rotor TX-1000 Thermo Scientific 10033-778
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3 (7), 596-603 (2002).
  2. Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31 (1987).
  3. Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85 (9), 3009-3013 (1988).
  4. Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54 (3), 433-439 (1988).
  5. Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60 (3), 487-494 (1990).
  6. Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425 (6960), 859-864 (2003).
  7. Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2448-2461 (2016).
  8. Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  9. Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22 (7), 2159-2164 (2016).
  10. Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16 (15), 1414-1429 (2017).
  11. Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33 (6), 703-716 (2015).
  12. Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4 (11), 973-982 (1994).
  13. Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15 (6), 122 (2014).
  14. Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12 (5), 1947-1954 (1993).
  15. Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7 (7), 903-916 (1996).
  16. Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13 (16), 3772-3781 (1994).
  17. Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131 (1995).
  18. Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -. E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25 (6), 839-850 (2007).
  19. Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92 (21), 9638-9642 (1995).
  20. Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13 (3), 1675-1685 (1993).
  21. Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17 (2), 571-583 (1997).
  22. McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12 (1), 75-85 (1993).
  23. Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242 (1991).
  24. Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786 (1), 49-59 (2008).
  25. Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119 (12), 2401-2404 (2006).
  26. Zhu, X., Chang, K. -. H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -. H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270 (33), 19545-19550 (1995).
  27. Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130 (3), 507-518 (1995).
  28. Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26 (3), 214-226 (1993).
  29. Christie, M., Chang, C. -. W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428 (10A), 2060-2090 (2016).
  30. Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
  31. Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192 (5), 855-871 (2011).
  32. Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154 (6), 1300-1313 (2013).
  33. Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17 (13), 1173-1179 (2007).
  34. Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13 (4), 275-283 (2003).
  35. Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25 (10), 4062-4074 (2005).
  36. Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7 (9), 1598-1608 (2008).
  37. Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11 (10), 1070-1083 (2012).
  38. UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45 (D1), D158-D169 (2017).
  39. Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3 (104), ra3 (2010).
  40. Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105 (31), 10762-10767 (2008).
  41. Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69 (12), 2495-2505 (2013).
  42. Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279 (20), 20613-20621 (2004).
  43. Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10171-10176 (2009).
  44. McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5 (5), 591-602 (2001).
  45. Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62 (13), 1284-1295 (1990).
  46. Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281 (33), 23545-23556 (2006).
  47. Hong, K. U., Kim, H. -. J., Kim, H. -. S., Seong, Y. -. S., Hong, K. -. M., Bae, C. -. D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284 (24), 16501-16512 (2009).
  48. Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88 (1999).
  49. Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262 (5142), 2050-2054 (1993).
  50. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).
  51. Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (18), 2075-2081 (2003).
  52. Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43 (2), (2017).
  53. Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7 (22), 3556-3563 (2008).
  54. Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103 (3), 608-613 (2006).
  55. Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276 (24), 20913-20923 (2001).
  56. Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274 (46), 32631-32637 (1999).

Tags

CDK1PhosphorylationKinase AssayCell CycleCENP-FProtein ExpressionE. ColiLB MediumAntibioticsProtein Purification
check_url/57674?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay. J. Vis. Exp. (135), e57674, doi:10.3791/57674 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image