本研究提供了一种经过验证和优化的人子宫内膜基质细胞分离与培养的实验方案，可用于 体外 蜕膜化检测。此外，本研究提供了一种利用siRNA在人子宫内膜基质细胞中高效敲低特定基因的详细方法。
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本文内容
摘要
摘要
人类子宫内膜基质细胞（HESC）从成纤维细胞样形态分化为分泌性蜕膜的过程，是胚胎植入母体子宫内膜所必需的转变。蜕膜化异常已被证实是导致胚胎植入失败及随后早期流产的根本原因。因此，阐明蜕膜化的分子机制有助于提高成功妊娠的几率。体内人工蜕膜化研究常因涉及人类研究的伦理困境以及动物模型中的转化复杂性而受到限制。因此，通常采用原代细胞培养的体外实验方法，通过激素调控来研究蜕膜化过程。本研究提供了一种详细的HESC分离方法，以及通过在培养基中添加激素实现人工蜕膜化的操作流程。此外，本研究还提供了一种利用脂质体介导的siRNA转染技术，对任意目的基因进行敲低的优化方法。该实验方案可有效提高细胞培养的纯度和产物得率，从而最大限度地将该模型作为可靠手段，用于解析蜕膜化背后的分子机制，并对蜕膜化后的子宫内膜基质细胞所分泌的因子进行定量分析。
引言
在初潮至绝经期之间的阶段，育龄期女性会经历以激素调控的子宫内膜增殖、分化及随后脱落的月度周期，为妊娠做准备，这一过程称为月经1,2。人类子宫内膜的这些生理变化对于胚胎正确植入子宫壁至关重要1。子宫内膜的改变，包括形态学和生物化学方面的适应性变化，均由卵巢类固醇激素雌激素和孕酮（P4）在整个月经周期中进行调控3,4,5。在增殖期（又称卵泡期），排卵前雌激素水平上升，启动子宫内膜增厚。排卵后进入分泌期（又称黄体期），P4浓度显著升高，诱导子宫内膜基质细胞（ESC）从成纤维细胞样形态转变为圆形、上皮样蜕膜细胞，这一过程称为蜕膜化4,6。已有研究证实，蜕膜化异常是导致胚胎植入失败及随后早期流产的根本原因之一4,7,8。因此，阐明蜕膜化的分子机制，有助于早期妊娠丢失的诊断与治疗。
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方案
本研究中收集的所有人子宫内膜活检样本均来自圣路易斯华盛顿大学妇产科系，采集过程使用了经机构审查委员会（IRB）批准的书面知情同意书。
1. 准备
- 向培养基瓶中加入青霉素至终浓度为100 U/mL，链霉素至终浓度为100 µg/mL，配制500 mL 1× Hank's平衡盐溶液（HBSS），后续称为HBSS+培养基。
- 配制500 mL含酚红、L-谷氨酰胺和15 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）的杜尔贝科改良伊格尔培养基：营养混合物F-12（DMEM/F12），向培养基瓶中加入1%抗生素-抗真菌素溶液（终浓度为100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B），该培养基后续简称为HESC分离培养基。
- 准备500 mL含酚红、L-谷氨酰胺和15 mM HEPES的DMEM/F12培养基，加入10%胎牛血清（FBS）、1x Na2HCO3，以及1%青霉素（10,000 U/mL）和链霉素（10,000 µg/mL）（Pen Strep）加入培养基瓶中（下文简称HESC培养基）。
- 在含有培养基的瓶子中（下文简称脱膜化培养基），配制500 mL含L-谷氨酰胺、2.4 g/L碳酸氢钠和HEPES的低血清培养基，并添加2%活性炭处理胎牛血清（csFBS）和1%青霉素-链霉素（Pen Strep）。 ....
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结果
人子宫内膜基质细胞培养中的蜕膜化
分离后，将人子宫内膜基质细胞培养至形成单层，汇合度达到80-90%，并进行诱导 体外 通过用10 nM E2处理诱导蜕膜化， 1 µM MPA，以及 50 µM cAMP（EPC）。与形态学变化相关的 体外 蜕膜化在 图1A蜕膜化过程中，人子宫内膜基质细胞（HESCs）的细胞骨架发生重构，由细长的成纤维细胞样形态转变为圆形的上皮样细胞。因此，通过鬼笔环肽染色以确认HESC蜕膜化过程中的细胞骨架重排。鬼笔环肽是一种高度特异性的双环肽，可用于标记肌动蛋白纤维，从而可视化与细胞骨架重构一致的形态变化。 体外 蜕膜化图1B).
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讨论
女性生殖月经周期的特征是黄体期中孕酮水平升高，从而诱导子宫内膜基质细胞（ESC）分化为圆形的、类似上皮的分泌细胞3,8。蜕膜化的启动具有物种依赖性。在人类中，蜕膜化在孕酮浓度升高时自发发生，而小鼠则需要胚泡的存在10,11。这种蜕膜化机制的差异凸显了在人类细胞系中研究细胞分化的可转化优势。通过原代细胞培养进行的体外实验常被用于探究激素对蜕膜化的调控作用4,6,10。然而，该方法的局限性在于难以获得大量周期阶段一致且妊娠史无显著差异的人体组织样本。尽管如此，可通过提前充分规划研究方案以确保获得充足的样本，并将子宫内膜活检安排在月经周期的增殖期（第9天至第12天），从而最大限度地减少这些局限性。
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披露
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）/国立儿童健康与人类发育研究所（NICHD）资助项目（R00 HD080742）以及华盛顿大学医学院启动资金支持，资助对象为R.K.。我们感谢华盛顿大学生育诊所提供了子宫内膜活检样本。
致谢
作者无任何利益冲突需要披露。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Opti-MEM I (1X) 低血清培养基 | Gibco | 31985-070 | 用于蜕膜化培养基 |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| 台盼蓝染液 (0.4%) | Gibco | 15250-061 | 用于细胞计数 |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | 用于RNA提取/纯化 |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA 内源性对照 | Life Technologies | 4319413E | 用于qPCR内参对照 |
| TaqMan 基因表达检测 泌乳素探针 | Applied Biosystems | 4331182 | 用于qPCR内参对照 |
| TaqMan 基因表达检测 IGFBP1 探针 | Applied Biosystems | 4331182 | 用于qPCR内参对照 |
| Phalloidin-iFluor 488 试剂 - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| 人泌乳素ELISA试剂盒 | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% 多聚甲醛 | Alfa Aesar | 30525-89-4 | 固定剂 |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | 转染试剂 |
| 含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36935 | 用于封片 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 活性炭处理胎牛血清 | Sigma | F6765-500ML | |
| 碳酸氢钠 (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS 试剂 | Fisher Scientific | 45001749 | |
| 溶组织梭菌胶原酶 | Sigma | C0130-1G | |
| 牛胰脱氧核糖核酸酶 I | Sigma | DN25-100MG | |
| 醋酸甲羟孕酮 | Sigma | M1629-1G | 用于EPC培养基 |
| 雌二醇 | Sigma | E1024-1G | 用于EPC培养基 |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | 用于EPC培养基 |
| 精细直剪手术剪 | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan 基因表达检测 NCOA2 探针 | Applied Biosystems | 4351372 | |
| 胎牛血清，热灭活 | Gibco | 10-082-147 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s 平衡盐溶液 | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL 圆锥形聚丙烯Falcon管 | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 镊子 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm 玻璃培养皿 | VWR | 75845-546 | |
| 40 微米细胞筛 | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 水浴锅 | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE 离心机 | Corning | 6755 | |
| 人NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | 基因特异性qPCR探针 |
| Steri-cycle i160 CO2 培养箱 | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | 用于RNA定量 |
| 磷酸盐缓冲液 | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm 倾斜颈细胞培养瓶 | Corning | 430641U | |
| 6 孔无热原细胞培养板 | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm 倾斜颈细胞培养瓶 | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL 圆锥形聚丙烯Falcon管 | Corning | 352099 | |
| 10 mL 注射器 | BD | 302995 | |
| 1300 系列 A2 生物安全柜 | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 离心机 | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast 实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL 免疫荧光显微镜 | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica 倒置光学显微镜 | Leica | DMi1 | |
| Illustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel 电子表格 | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm 盖玻片 | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line 血细胞计数板 | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-巯基乙醇 | Fisher Bioreagents | BP176-100 | 用于RNA裂解缓冲液 |
| 1.2 mL 外螺纹聚丙烯冷冻管 | Corning | 430658 | 用于冷冻HESC细胞 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | 用于冷冻培养基 |
参考文献
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualiza....
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重印与许可
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