לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization
Summary
מחקר זה מציג שגרה מאומת וממוטב עבור הבידוד של התרבות האנושית תאי סטרומה רירית הרחם לנהל במבחנה decidualization assay. יתרה מזאת, מחקר זה מספק שיטה מפורט ביעילות תמונות ציפורים גנים ספציפיים באמצעות siRNAs בתאי סטרומה רירית הרחם אדם.
Abstract
הבידול של רירית הרחם סטרומה תאים אנושיים (HESC) ממראה כמו פיברובלסט. לתוך רותמי הפרשה היא שינוי נדרש השרשת לתוך הרחם רירית רחם אימהי. Decidualization לא תקין נוצרה כמו שורש לבעיה כשל השרשה, הבאים הפלה העובר מוקדם. לכן, להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization הוא יתרון בשיפור שיעור לידות מוצלחות. In vivo המבוסס על מחקרים של decidualization מלאכותיים הם הגבלת לעיתים קרובות עקב דילמות אתיות המשויך מחקר אנושי, כמו גם הסיבוכים translational בתוך חייתיים. כתוצאה מכך, במבחנה מבחני דרך התרבות התא הראשי מנוצלים לעיתים קרובות כדי לחקור את האפנון של decidualization באמצעות הורמונים. מחקר זה מספק נוהל מפורט בידודו של HESC ו- decidualization מלאכותיים עוקבות באמצעות תוספת של הורמונים למדיום culturing. עוד יותר, מחקר זה מספק שיטה מעוצב היטב נוקאאוט בכל הגן עניין על-ידי ניצול siRNA מבוססי השומנים transfections. פרוטוקול זה מאפשר אופטימיזציה של טוהר התרבות, כמו גם התשואה מוצר, ובכך למקסם את היכולת לנצל את המודל הזה בתור שיטה אמינה כדי להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization, כימות עוקבות של סוכנים מופרשים על-ידי decidualized תאי סטרומה רירית הרחם.
Introduction
בין השלבים של הוסת, גיל המעבר, נשים בגיל הפריון לעבור מחזורים חודשיים של הורמון מוסדר התפשטות רירית הרחם, בידול, ושפך הבאים לקראת הריון בתהליך המכונה הווסת1 ,2. ושינויים פיזיים אלו של רירית הרחם האדם נחוצים להשתלת עובר תקין לתוך הרחם1. שינויים של רירית הרחם, כולל עיבודים מורפולוגי וביוכימי, הן מתווכת לאורך המחזור החודשי באמצעות הורמונים סטרואידים השחלות אסטרוגן ופרוגסטרון (P4)3,4,5. במסגרת שלב המקדימות (או הזקיקים), רמות אסטרוגן preovulatory עלייה, ייזום עיבוי רירית הרחם. בעקבות ביוץ, השלב הפרשה (או luteal) מקדמת לעלייה משמעותית בריכוז P4, גרימת שינוי מורפולוגי תאי סטרומה רירית הרחם (ESC) של פיברובלסט דמוי מראה מעוגל, תאי אפיתל דמויי decidual בתהליך המכונה decidualization4,6. Decidualization לא תקין נוצרה כמו שורש לבעיה עבור ההשתלה כשל ו עוקבות בתחילת העובר הפלה4,7,8. לכן, להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization הוא יתרון באבחון וטיפול של אובדן הריון מוקדם.
כיום, מספר מתודולוגיות מנוצלים כדי לחקור את ההשפעות הבסיסית של decidualization על תאי סטרומה רירית הרחם. In vivo, הרחם העכבר יכולה להיגרם באופן מלאכותי על decidualization באמצעות גירוי מכני (קרי,מגרד) או שמן ההזרקה הרחם הורמונאלית להתקפת9. נבדל בני אדם, גירוי מלאכותי זה מקדם את הבידול של לומן הרחם על ידי מתן את המראה של הבלסטוציסט נוכחות, צעד זה נדרש עבור אתחול של decidualization מכרסמים10,11. בהתאם לכך, עקב סיבוכים translational הקשורים בבעלי חיים של דילמות סביב ויוו המבוסס על מחקרים בבני אדם, decidualization מבוסס מודלים ביותר בהצלחה נלמדים במבחנה.
במחקר זה, נושאים מגויסים דרך המיקום של פרסומות בעיתונים מקומיים בשתי באנגלית ובספרדית. נושאים מזוהה מועמדים מתאימים למחקר זה מובאים להיפגש עם מתאם מחקר, שבו מתוארים על גילוי מלא של סיכונים פוטנציאליים. אישור ההזמנה הבנה מלאה של הסיכונים הפוטנציאליים, מושגת ההסכמה של הנבדקים בצורות בכתב ומילולית. נושא הסכמה כוללת רשות (1) עוברים דם ורידי אחסון (2) לטווח ארוך של הרקמות שלהם למטרות מחקר עתידי, (3) מסכים ליצירתו של תרבויות העיקרי של דגימות רקמה שנאספו. בעקבות הסכמה, נותנים לנסיינים טופס כדי להשלים איזו self-identification המותר של גזע/מוצא אתני ו/או הזכות של סודיות. ביקור עוקבות מתוזמנת כדי להשיג את הביופסיה רירית הרחם בהתבסס על המחזור החודשי של הנושא. מתנדבים מגויס מחקר זה לשקף שני אתנית וגזעית דמוגרפיים של אזור המטרופולין סנט לואיס כפי שתועדו בידי מפקד 2012 ו לא היה כרוך ההשתתפות של כל אוכלוסיה פגיעה כולל נשים בהריון, העוברים, עוברי, ילדים מתחת לגיל 18 שנים של גיל או קבוצות פגיעות אחרות. דרישות הכשירות להשתתפות האוסף דגימת ביופסיה כוללים (1) להיות בין הגילאים 18-45 שנים (2) שיש מווסת סדירה (25-32 ימים) (3) לאחר ההריון הנוכחי וללא שימוש באמצעי מניעה הורמונליים/תוך רחמי ההתקן 30 ימים לפני ההרשמה (4) אין זיהום נרתיקי הנוכחי או מחלות המועברות במגע מיני (5) נתקל אין טיפולים אנטיביוטיים הנוכחי, ו (6) נתקל אין פאפ חריגות הנוכחי.
במסגרת מחקר זה, תאי סטרומה רירית הרחם (HESC) אדם תרבותי, המושרה באופן מלאכותי לעבור במבחנה decidualization דרך תוספת של הורמונים (אסטרדיול (E2) medroxyprogesterone אצטט (MPA), אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה)) למדיום. בשיטה זו, היא מידת decidualization שונה בהתבסס על המספר הכולל של ימים של טיפול הורמונלי. יחד עם התמורות cytoskeletal, תוספי ההורמונלי גורם עיבודים ביוכימי שבו התאים decidual לחוות הפרשה כמו איכויות2,4. הביטוי של גנים הולמרק, פרולקטין (PRL) ו פקטורי גדילה דמויי אינסולין מחייב חלבון 1 (IGFBP1), יכול להיות מנוצל כדי לאשר ולכמת את מידת HESC decidualization5,12, 13 , 14. חשוב, הכדאיות של פרוטוקול זה לנהל גנים ספציפיים נוקאאוט גם הוכח.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחזור החודשי הרבייה הנשי מאופיין על ידי עלייה ברמות הפרוגסטרון לאורך כל שלב luteal, ובכך גרימת את decidualization של ESC לתוך תאים הפרשה עגול, אפיתל דמויי3,8. אתחול של decidualization הוא מין התלויים. בבני אדם, decidualization מתרחשת באופן ספונטני על עליית ריכוז הפרוגסטרון, ואילו עכבר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אין לחשוף.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
