생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립
Summary
이 연구는 분리와 decidualization 분석 결과 생체 외에서 실시 하 인간의 자궁내 막 기질 세포의 문화에 대 한 검증 및 최적화 절차를 선물 한다. 또한,이 연구를 효율적으로 최저의 자세한 방법을 siRNAs를 사용 하 여 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 특정 유전자를 제공 한다.
Abstract
인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 분 비 decidua에 구와 같은 모습에서의 분화는 어머니 자 궁의 자 궁 내벽에 배아 이식에 필요한 변환입니다. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 성공적인 출생의 속도 향상에 유리 하다. Vivo에서 기반 인공 decidualization의 연구는 종종 동물 모델에서 변환 합병증 뿐 아니라 인간의 연구와 관련 된 윤리적 딜레마 때문 제한 됩니다. 결과적으로, 기본 세포 배양을 통해 분석 실험 체 외에 호르몬을 통해 decidualization의 변조를 탐험 자주 활용 됩니다. 이 연구는 HESC 고립과 자란 보통 호르몬의 보충을 통해 후속 인공 decidualization에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한,이 연구 하면 잘 설계 된 최저에 관심사의 어떤 유전자 지질 기반 siRNA transfections를 활용 하 여 있습니다. 이 프로토콜 허용 기본 decidualization, 및의 후속 정량화 하는 분자 메커니즘을 이해 하는 신뢰할 수 있는 방법으로이 모델을 활용 하는 능력을 극대화 함으로써 제품의 수율 뿐 아니라 문화 순도의 최적화 decidualized 자궁내 막 기질 세포에 의해 분 비 대리인입니다.
Introduction
Menarche의 단계와 폐 경, 생식 연령의 여성 호르몬 규제 자궁내 막 증식, 차별화, 임신 생리1 이라는 프로세스에 대 한 준비에 후속 흘리기의 월별 주기 받아야 ,2. 인간의 endometrium의 실제 수정 등은 자 궁 벽1에 적절 한 배아 이식 필요 합니다. 난소 스테로이드 호르몬 에스트로겐과 황 체 호르몬 (P4)를 통해 생리 주기 변경 endometrium, 형태학 및 생화학 적인 적응을 포함 하 여의 중재는3,,45. 증식 (follicular) 단계 내 preovulatory 에스트로겐 수준의 증가, endometrium 두껍게 시작. 배 란, 다음 분 비 (또는 luteal) 단계 반올림, 상피 같은 decidual 셀 구와 같은 모습에서 자궁내 막 기질 세포 (ESC)의 형태학 상 변화를 유도 하는 P4 농도에 상당한 증가 촉진 decidualization4,6로 알려진 프로세스. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산4,,78에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 진단과 초기 임신 손실의 처리에 유리 하다.
현재, 자궁내 막 기질 세포에서 decidualization의 기본 효과 탐험 여러 방법론 활용 됩니다. Vivo에서, 마우스 궁 기계적 자극 (즉,긁 적)를 통해 decidualization에 대 한 인위적으로 유도 될 수 있다 또는 기름9hormonally 끝났다 자 궁 주입. 다른 인간,이 합성 자극 blastocyst 존재, 설치류10,11decidualization의 개시에 필요한 단계의 모양을 제공 하 여 자 궁 루멘의 분화를 촉진 합니다. 따라서, 동물 모델 및 인간에서 vivo에서 기반 연구를 둘러싼 윤리적 딜레마와 관련 된 변환 합병증으로 인해 decidualization 기반 모델은 가장 성공적으로 공부 생체 외에서.
이 연구에서 과목 두 지역 영어와 스페인어 신문에서 광고의 배치를 통해 채용 됩니다. 과목이이 연구에 대 한 적합 한 후보자로 식별 되는 가져온 연구 코디 네이 터, 잠재적인 위험의 전체 공개 토론 된다와 나. 관련 된 잠재적인 위험에 대 한 완전 한 이해의 확인, 과목의 동의 서 면과 구두 모양에서 달성 했다. 주제 동의 (1) 받을 미래 연구 목적을 위해 그들의 조직의 정 (2) 장기 저장 (3) 수집 된 조직 표본에서의 기본 문화 창조에 동의 하는 권한이 포함 됩니다. 동의 다음 과목 인종/민족성의 비공개에 대 한 권리는 허용 된 자가 식별에 완료 하는 폼을 받는다. 후속 방문 endometrium 생의 생리 주기에 따라 달성 예정 이다. 이 연구에 모집 하는 자원 봉사자로 2012 인구에 의해 문서화 세인트 루이스 수도권의 민족과 인종 인구를 반영 하 고 임산부, 태아, 태아를 포함 하 여 모든 취약 한 주민들의 참여를 포함 하지 않았다 나이, 또는 다른 취약 한 그룹의 18 세 미만 어린이. 생 검 샘플 컬렉션에 참여 하기 위한 자격 요건 포함 (1) 일반 생리 주기 (25-32 일) (3) 현재 임신 이나 호르몬 자궁내 장치 피임약의 사용 하는 데는 데 18-45 년 (2)의 나가 사이 되 고 현재 질 감염이 나 성병 (5) 없는 현재 항생제 치료와 (6) 등록 (4) 전 30 일에 대 한 없음 현재 비정상적인 경부 데.
이 연구에서 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 배양 하 (estradiol (e 2), medroxyprogesterone 아세테이트 (MPA), 및 순환 아데노신 호르몬의 보충을 통해 생체 외에서 decidualization을 인위적으로 유발 monophosphate (캠프)) 매체에. 이 방법에서는, decidualization의 정도 호르몬 치료의 일의 총 수에 따라 변경 됩니다. Cytoskeletal 재배치와 함께, 호르몬 보충 decidual 세포 분 비 같은 자질2,4를 경험 하는 생 화 확 적인 적응을 유도 합니다. Prolactin (PRL)와 인슐린 같은 성장 인자 의무적인 단백질 1 (IGFBP1), 같은 각 인 유전자의 표정은 확인 하 고 계량 HESC decidualization5,12, 의 정도를 이용 될 수 있다 13 , 14. 중요 한 것은,이 프로토콜을 유전자 특정 최저 생존도 시연 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여성 생식 생리 주기는 라운드, 상피 같은 분 비 세포3,8에 ESC의 decidualization를 유도 함으로써 상승 luteal 단계 내내 황 체 호르몬 수준에 의해 특징입니다. Decidualization의 개시는 종 의존. 인간에서는, decidualization 발생 합니다 자연 호르몬 농도의 증가 따라 쥐 해야 blastocyst 존재10,11. Decidualization에서의 이러한 불…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 공개 없다.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
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