En dråbe mikrofluid tilgang og Microsphere-PCR-amplifikation til enkeltstrenget DNA amplikoner
Summary
Dette værk indeholder en metode til fremstilling af droplet-baserede mikrofluid platforme og anvendelsen af polyacrylamid mikrokugler for microsphere-PCR-amplifikation. Microsphere-PCR-metoden gør det muligt at opnå enkeltstrenget DNA amplikoner uden adskillelse dobbelt-strenget DNA.
Abstract
Droplet-baserede mikrofluidik aktiverer pålidelig produktion af homogene mikrokugler i den mikrofluid kanal, giver kontrolleret størrelse og morfologi af den opnåede microsphere. En copolymeriseret med et acrydite-DNA-sonder microsphere blev fabrikeret. Forskellige metoder som asymmetriske PCR, exonuclease fordøjelse og isolation på streptavidin-belagt magnetiske perler kan bruges til at syntetisere enkeltstrenget DNA (ssDNA). Disse metoder kan ikke effektivt bruger store mængder af højt oprenset ssDNA. Her, beskriver vi en microsphere-PCR-protokol beskriver hvordan ssDNA kan være effektivt forstærkes og adskilt fra dsDNA simpelthen af pipettering fra en PCR reaktion tube. Forstærkning af ssDNA kan anvendes som potentielle reagenser for DNA microarray og DNA-SELEX (systematisk udvikling af ligander af eksponentielle berigelse) processer.
Introduction
Enkeltstrenget DNA (ssDNA) er blevet grundigt overvejet som en molekylær anerkendelse element (MRE) på grund af dets iboende egenskaber for DNA-DNA hybridisering1,2. Udviklingen af ssDNA syntetisk systemer kan føre til biologiske applikationer såsom DNA microarrays3, oligotherapeutics, diagnostik og integreret Molekylær sensing baseret på supplerende interaktioner4,5.
Til dato, har mikrometer skala polymer partikler med held påvist ved hjælp af mikrofluid enheder. Flere mikrofluid teknikker har vist sig for at være effektive til at producere meget homogen mikrokugler på kontinuerlig flow i microchannel miljø6,7.
I studiet af Lee et al. 8, en droplet-baserede mikrofluid platform for mikrofluid syntese af copolymerizable oligo-microsphere og ssDNA forstærkning blev rapporteret. Mikrofluid platform består af to PDMS (Polydimethylsiloxan) lag: en øvre del med en mikrofluid kanal netværk til at generere microsphere og en bunden flad del. Disse består af tre slags PDMS fluidic kanaler: 1) en flow med fokus kanal for slipværktøj generation, 2) en serpentine kanal til at blande to løsninger og 3) en sekventiel polymerisering kanal for microsphere størkning. Når to ikke-blandbare strømme er indført i en enkelt PDMS fluidic kanal, kan strømme tvinges gennem den smalle åbning struktur. Strømmen adfærd som kanal geometri, strømningshastighed og viskositet påvirke størrelse og morfologi af microsphere. Derfor, den største flydende strøm kan opdeles i mikroskala monospheres9,10.
Her er en detaljeret microsphere-PCR-protokol fastsatte forstærkning af ssDNA. Først, en droplet-baserede mikrofluid enhed designproces er beskrevet. Derefter, den måde, i hvilke polyacrylamid mikrokugler kan være functionalized med tilfældig DNA skabelon i en supplerende måde er forklaret. Endelig er en microsphere-PCR-protokol for uddybning af ssDNA vist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kontaminanter i dsDNA er et stort problem i ssDNA forstærkning. Det er fortsat vanskeligt at minimere dsDNA forstærkning i konventionelle asymmetriske PCR forstærkning15. Desuden, selv om tekniske forbedringer for at generere ssDNA har gjort det muligt for os at øge effektiviteten af prøven overførselshastighed, er ssDNA isolation stadig problematisk på grund af sin høje omkostninger og ufuldstændige rensning udbytter.
Asymmetriske PCR er en af de mest udfordre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse er understøttet af et projekt med titlen “kooperativ forskningsprogram for landbrug Science & Technology Development (projekt nr. PJ0011642) “finansieret af landdistrikternes udvikling Administration, Republikken Korea. Denne forskning blev også delvist støttet af en bevilling (NRF-2017R1A2B4012253) af den grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab, IKT & fremtid planlægning, Republikken Korea. Denne forskning blev også støttet af tilskud (N0000717) af programmet uddannelse for kreative og industrielle konvergens finansieret af Ministeriet for handel, industri og energi, Republikken Korea.
Materials
| liquid polydimethylsiloxane, PDMS | Dow Corning Inc. | Sylgard 184 | Components of chip |
| 40% Acrylamide:bis solution (19:1) | Bio-rad | 1610140 | Components of Copolymerizable oligo-microsphere |
| Ammonium persulfate, APS | Sigma Aldrich | A3678 | Hardener of acrylamide:bis solution |
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | Catalyst of ammonium persulfate |
| Mineral oil | Sigma Aldrich | M5904 | Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents |
| Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes | Bioneer | synthesized | Table 3. Sequence information |
| ssDNA acrydite labeled probe | Bioneer | synthesized | Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents |
| Tris | Biosesang | T1016 | Components of TE buffer, pH buffer solution |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+) |
| Ex taq | Takara | RR001A | ssDNA amplification |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 510 | Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface |
| Light Microscope | Nikon Instruments Inc. | eclipse 80i | Caculating number of microspheres |
| T100 Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | ssDNA amplification |
| Hand-held Corona Treater | Electro-Technic | BD-20AC Laboratory Corona Treater | Hydrophilic surface treatment |
| Hot plate | As one | HI-1000 | heating plate for curing of liquid PDMS |
| Syringe pump | kd Scientific | 78-1100 | Uniform flow of Solution I and Solution II |
| Compressor | Kohands | KC-250A | Flow control of Solution III |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | Caculating number of microspheres |
References
- Smith, A. J. The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method. Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).
- Sekhon, S. S., et al. Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays. Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).
- Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray. Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).
- Sekhon, S. S., et al. Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP). Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).
- Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3′–>5′ exonuclease activity of DNA polymerase gamma. Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).
- Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics. Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).
- Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets. Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).
- Lee, S. H., et al. On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification. PLoS One. 11 (7), e0159777 (2016).
- Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels. Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).
- Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device. Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).
- Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system. Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).
- Olsen, T. R., et al. Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics. Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).
- Dorris, D. R., et al. Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios. BMC Biotechnology. 3, 6 (2003).
- Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).
