Vi presenterer en protokoll for antimikrobielle karakterisering av avanserte materialer. Her, den antimikrobielle aktiviteten på materielle overflater er målt ved to metoder som utfyller hverandre: er basert på agar disk diffusjon test, og den andre er en standard prosedyre basert på ISO 22196:2007-norm.
Utviklingen av nye avanserte materialer med utvidede egenskaper blir stadig viktigere i en rekke bioteknologi programmer. Dermed blir mange romanen biologisk materiale utviklet å etterligne miljø kreves for biomedisinsk programmer som tissue engineering og kontrollert stoff levering. Utviklingen av materialer med bedre egenskaper for immobilisering av celler eller enzymer er også en gjeldende emne for forskning i bioprocess engineering. En av de mest attraktive egenskapene til et materiale i disse programmene er imidlertid antimikrobielle kapasiteten til å unngå eventuelle uønskede infeksjoner. For dette presenterer vi lett-å-følge protokollene for antimikrobielle karakterisering basert på (i) agar disk diffusjon testen (diffusjon metode) og (ii) ISO 22196:2007-norm å måle den antimikrobielle aktiviteten på materielle overflater (kontakt metode). Denne protokollen må utføres ved hjelp av Gram-positive og Gram-negative bakterier og gjær for å dekke et bredt spekter av mikroorganismer. Eksempel testes 4 materialer med forskjellige kjemiske naturer etter denne protokollen mot Escherichia coliog Staphylococcus aureus, og Candida albicans. Resultatet av disse testene viser ikke-antimikrobielle aktivitet for første materialet og øke antibakteriell aktivitet mot Gram-positive og Gram-negative bakterier for de andre 3 materialene. Men er ingen av 4 stand til å hemme veksten av Candida albicans.
Implantatet feil er ofte en konsekvens av mikrobielle infeksjoner som oppstår på tross av antimikrobielle profylakse og aseptiske arbeidsforhold. Dette problemet er forårsaker svært høy helsetjenester kostnader og sørgelig blant pasienter1. Viktig bakterier som Staphylococcus aureus anses nå å være veldig farlige patogener i nosokomiale infeksjoner knyttet katetre og andre medisinske implantater og er de viktigste forurensningene av medisinske instrumenter2. Derfor utviklingen av romanen antimikrobielle strategier er et presserende behov for både daglig og medisinsk bruker.
Antimikrobielle midler inkluderer antibiotika3, kvartære ammonium forbindelser4, ioner/metalloksider5og antimikrobielle peptider (ampere)6. Antibiotika er gradvis blir mindre effektiv på grunn av resistens7, som er en økning på grunn av antibiotika overforbruk8. Kvartære ammonium forbindelser er bare veldig effektivt en kortvarig bruk mikrobiell motstand9. Ioner/metalloksider har lenge vært benyttet som svært effektiv antimikrobielle midler og brukes i mange vanlige kommersielle produkter inkludert bandasjer, vann filtre, maling, etc.10,11,12. Imidlertid har det vært vist at disse typer forbindelser kan være giftig for enkelte typer pattedyrceller13.
Forsterkere viser utmerket antimikrobielle og immunmodulerende egenskaper14,15, og bakterier synes å finne det svært vanskelig å utvikle en motstand mot dem16. Men er prosessen for å produsere ren ampere dyrt; Derfor er en storstilt produksjon ikke levedyktig. Dermed utviklet strategier for å motvirke problemene i produsere forsterkere har vært (f.eks, små molekylære antibakterielle peptoid etterlikner17, peptoids18, α-peptider19 og β-peptider20). Methacrylate-slutt polypeptides og polypeptoids har blitt syntetisert for antimikrobielle og antifouling belegg21.
Utvikling av nye antimikrobielle midler som avanserte materialer i ren eller hybrid form, kunne forebygge og behandle multidrug-resistente infeksjoner, er stadig nødvendig. En rekke nye avanserte materialer for mange bioteknologi felt som vev og bioprocess utvikling har blitt utviklet med forbedret kjemiske og fysiske egenskaper i de siste tiårene gjennom flere metoder: plasma-polymerisasjon pode på en hydrofobe substrat22,23,24, skreddersy crosslinking tetthet25,26, polymerisasjon i løsningen27,28,29 , 30, porogen oppløsning31,32, og innlemmelse av nanomaterialer som Grafén oksid (gå)33,34,35,36 og Carbon nanofibers (CNFs)37.
Studiet av antimikrobielle kapasiteten på disse nye materialer eksponentielt kan øke deres potensielle bioteknologi anvendbarhet og har derfor blitt viktig. Vi presenterer en lett-å-følge protokollen for å kvantifisere den antimikrobielle aktiviteten av slike nye avanserte materialer. Her, etter eksempel utarbeidelse, to utfyllende metoder følges: først er basert på det agar disk diffusjon test38 (diffusjon metode) og andre er basert på ISO 22196:2007 normen39 å måle den antimikrobielle aktiviteten på materielle overflater (kontakt metode).
Den antimikrobielle aktiviteten av nye avanserte materialer kan analyseres av denne lett-å-følge protokollen bestående av 2 komplementære prosedyrer basert på 2 eksisterende metoder: agar disk spredningen test38 og den antimikrobielle aktiviteten målt på materielle overflater i henhold til ISO 22196:2007 normen39.
I denne forskningsfelt er mange av de antimikrobielle testene rapportert i litteraturen svært analysen-avhengige. Derfor er det svært viktig å ha detaljert og konsekvent protokoller på plass over laboratorier. Denne artikkelen er et skritt i riktig retning. Videre, det kan være svært nyttig for mange forskere som er mindre erfarne i dette feltet og krever grundig, trinnvise fremgangsmåter du skal følge nøyaktige resultater.
Denne protokollen kan brukes med mange typer materialer kuttet i disk former av 10 mm diameter. Sprøtt materiale kan bli hovne i et egnet løsemiddel 1t gjengi kutte prosessen enklere. Dermed kan hydrofile materialer som alginater være hydrert i autoklaveres destillert vann. Andre løsemidler, for eksempel etanol og keton diklormetan, kan brukes til å svelle hydrofobe materialer 1t før klippe dem. Imidlertid noen materialer som poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) trenger ikke å være hovne og de kan bli kuttet direkte. Etter at er det svært viktig å tørke sample materiale diskene i et vakuum ovnen og sterilisere hver prøven med etanol og UV-stråling 1t for å unngå smitte risiko.
Denne protokollen anbefaler TSA og TSB som kultur medier og bruk av ren kulturer av 3 mikroorganismer å nå en rekke mikroorganismer: de Gram-positive bakteriene Staphylococcus aureus, Gram-negative bakterier Escherichia coli og gjær Candida albicans. Alternativ kultur medier og andre mikroorganismer trenger forskjellige inkubasjon forhold kan imidlertid også brukes med denne protokollen. Noen ganger er bare 1 microorganism testet for å ha en første idé om den antimikrobielle aktiviteten et nytt materiale.
Materialet viser sterke antimikrobielle aktivitet mot anbefalte 3 forskjellige typer mikroorganismer bør også testes mot antibiotika-resistente patogener som meticillinresistente Staphylococcus epidermidis (MRSE), som har vært vellykket benyttet med denne protokollen. Andre viktige narkotika-resistente mikroorganismer som forårsaker mye bekymring er de Gram-positive Meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) og vancomycin-resistente enterokokker (VRE) og Gram-negative Pseudomonas aeruginosa40,41.
Biofilm hemming og antimikrobielle aktiviteten av materialer mot andre typer mikroorganismer som virus og parasitter kan ikke testes med denne protokollen. Men gir denne protokollen svært nyttig utgangspunkt for en antimikrobiell studie av en ny avansert materiale.
I antimikrobielle agar disk diffusjon testen oppstår en kritisk trinn når eksempel disken har å bli plassert i midten av tallerkenen fordi noen materialer brett så snart de kommer i kontakt med agar media. I dette tilfellet anbefales det å bruke et sterilt par pinsett til å nøye brette prøven. På den annen side, i kontakt metoden, er det avgjørende å vaske kontrollen og eksempel disker godt med PBS av pipettering dem fire ganger etterfulgt av en kraftig vortexing og sonication for å sikre at ingen levedyktig mikroorganismer forblir adhered til materialet overflaten.
Denne video protokollen kan brukes i mange bioteknologi-programmer, for eksempel bioprocess engineering, vev engineering, kontrollerte stoffet levering, emballasje, avløpsvann og landbruk, som bruker biologisk materiale med en høyt ønskelig antimikrobielle kapasitet.
Resultatene med denne protokollen er kvalitativ (bilder) og kvantitativ (normalisert bredden på den antibakterielle “halo” og tap av levedyktighet) med en god analyse av sin reproduserbarhet (gjennomsnittlig ± standardavvik). Når du sammenligner ulike materialer, må disse mener verdier hentet med spredning og kontakt metoden resultater analyse analyseres av enveis ANOVA, etterfulgt av Tyrkias legge hoc analyse, for å studere hvis de er statistisk signifikant forskjellige (p < 0,01).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å erkjenne Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir for økonomisk støtte for dette gjennom 2017-231-001UCV og 2018-231-001UCV gir.
Cylindrical punch | 10 mm diameter | ||
Petri dishes | soria genlab | P101 | 90 mm diameter, sterile |
Tryptic soy agar (TSA) | Liofilchem | 610052 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Tryptic soy broth (TSB) | Liofilchem | 610053 | Dehydrated medium 500 g (powder) |
Sterile cotton swab | EUTOTUBO | 300200 | |
Centrifuge tubes | VIDRA FOC, SA | 429900 | 50 mL, sterile |
Ethanol | VWR | 83813360 | Absolute ethanol |
Sterile 48-wells plate | COSTAR | 3548 | Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene |
A pair of tweezers | BRAUN | 24612036 | Toothless |
Sterile phosphate buffered saline (PBS). | VWR | E404-100TAPBS | |
Vaccum oven with a connected vacuum pump | JP Selecta, SA | 5900620 | |
Laminar flow hood | TELSTAR Technologies, SL | TELSTAR AH-100 | 12.0 W lamp of UV-C radiation |
Class II Biological safety cabinet | LABOGENE | MARS 1200 | |
Incubator | ASTEC CO, LTD | SCA-165DR | |
Vortex mixer | Biosan | V-1 Plus | |
Spectrophotometer | Macherey-Nagel, Germany | Nanocolor UV/VIS II | |
Bunsen burner | JP Selecta, SA | 7001539 | |
Alcohol burner | VIDRA FOC, SA | 1658/20 | In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet |
Orbital shaker | sartorius stedim | 8864845 | |
Sonicator | SELECTA | 3000617 | 50/60 Hz |
Digital calliper | ACHA | 17-260 | 0-150 mm |
Serological pipette | Fisherbrand | 13-678-11 | 25 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-4950 | 5 mL, sterile |
Serological pipette | VWR | 612-5541 | 10 mL, sterile |
Micropipette | GILSON | FA10005P | Pipetman L P200L, plastic 20-200 µL |
Micropipette | GILSON | F123602 | Pipetman P1000, 200-1000 µL |
Micropipette | GILSON | FA10016 | Pipetman L P12X300L, 20-300 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-200-960 | 2-200 µL |
Micropipette tips | LABBOX | TIBP-1K0-480 | 100-1000 µL |
Pre-sterilized tube | INSULAB | 301402 | 10 mL |
Photo camera | Canon EOS 5D | Any camera with high resolution can also be utilized | |
Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus | strain V329 | Cucarella et al. J Bacteriol 183 (9), 2888–2896 (2001) | |
Gram-negative bacteria Escherichia coli | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 101 | |
Yeast Candida albicans | Colección Española de Cultivos Tipo CECT | CECT 1394 | |
Microcentrifuge tubes | DASLAB | 175508 | 1,5 mL |
Autoclave | JP Selecta, SA | 4002136 | |
Spectrophotometer-cuvettes | UVAT Bio CB | F-0902-02 | 4,5 mL |
Drigalski spatula | LABBOX | SPRP-L05-1K0 | Sterile, disposable |
glass balls (2 mm diameter) | Hecht Karl | 1401/2 | Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula |
Autoclave bags | DELTALAB | 200318 | To sterilize microbiological residues or contaminated material |
Electronic pipette filling device | JetPip | JET BIOFIL | |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-100-010 | 100 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-250-010 | 250 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-500-010 | 500 mL, for autoclaving culture media |
Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3 | LABBOX | SBG3-1K0-010 | 1000 mL, for autoclaving culture media |
Latex gloves | DENIA | 2278000000 | |
Indicator tape for sterilization | LABBOX | STAP-A55-001 | Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process. |
Universal test tube rack | LABBOX | MTSP-001-001 | To hold centrifuge tubes |
Microcentrifuge tube rack | VWR | 211-0210 | To hold microcentrifuge tubes |
Sterile loop | ACEFE S.A. | 100140055 | 10 µL of capacity for microbial culture |
Material M1 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 1 | |
Material M2 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 2 | |
Material M3 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type3 | |
Material M4 | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Material type 4 | |
Material C | Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir (UCV) | Control material |