Calorespirometry: एक शक्तिशाली, आक्रामक दृष्टिकोण सेलुलर ऊर्जा चयापचय की जांच करने के लिए
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन calorespirometry, दोनों गर्मी अपव्यय और श्वसन, जो ऊर्जा चयापचय का आकलन करने के लिए एक इनवेसिव दृष्टिकोण प्रदान करता है की प्रत्यक्ष और एक साथ माप । इस तकनीक का उपयोग कुल सेलुलर ऊर्जा प्रवाह की निगरानी के द्वारा ऊर्जा उपयोग के लिए एरोबिक और anaerobic दोनों मार्ग के योगदान का आकलन करने के लिए किया जाता है ।
Abstract
कई कोशिका लाइनों बुनियादी जैविक और जैव चिकित्सा अनुसंधान में इस्तेमाल किया एरोबिक और anaerobic श्वसन दोनों का एक संयोजन के माध्यम से ऊर्जा homeostasis बनाए रखने के । हालांकि, किस हद तक दोनों रास्ते सेलुलर ऊर्जा उत्पादन के परिदृश्य में योगदान लगातार अनदेखी की है । ग्लूकोज के स्तर संतृप्त करने में प्रसंस्कृत कोशिकाओं को बदल अक्सर एटीपी उत्पादन के लिए ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण पर एक कम निर्भरता दिखाने के लिए, जो सब्सट्रेट स्तर फास्फारिलीकरण में वृद्धि की भरपाई की है. चयापचय शिष्टता में यह बदलाव कोशिकाओं mitochondrial विषाक्त पदार्थों की उपस्थिति के बावजूद पैदा करना करने के लिए अनुमति देता है । बदल कोशिकाओं के बदल चयापचय शिष्टता की उपेक्षा में, एक दवा स्क्रीनिंग से परिणाम गलत व्याख्या की जा सकती है के बाद से संभावित mitotoxic प्रभाव मॉडल सेल का उपयोग कर पाया नहीं जा सकता है उच्च ग्लूकोज की उपस्थिति में कल्चरल लाइंस सांद्रता. इस प्रोटोकॉल का वर्णन दो शक्तिशाली तकनीक, respirometry और calorimetry, जो और सेलुलर एटीपी उत्पादन के लिए दोनों एरोबिक और anaerobic योगदान के मात्रात्मक और इनवेसिव मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है की बाँधना । एरोबिक और anaerobic श्वसन दोनों गर्मी है, जो calorimetry के माध्यम से निगरानी की जा सकती है उत्पंन करते हैं । इस बीच, ऑक्सीजन की खपत की दर को मापने एरोबिक श्वसन की हद का आकलन कर सकते हैं । जब दोनों गर्मी अपव्यय और ऑक्सीजन की खपत एक साथ मापा जाता है, calorespirometric अनुपात निर्धारित किया जा सकता है । प्रयोग से प्राप्त मूल्य तो सैद्धांतिक oxycaloric समकक्ष की तुलना में किया जा सकता है और anaerobic संवेदनाएं की हद तक ंयाय किया जा सकता है । इस प्रकार, calorespirometry दवा विकास, माइक्रोबियल विकास, और दोनों normoxic और hypoxic शर्तों के तहत मौलिक जैव ऊर्जा सहित जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत श्रृंखला का विश्लेषण करने के लिए एक अनूठी विधि प्रदान करता है ।
Introduction
जैविक प्रणालियों में, गर्मी जारी या चयापचय के दौरान तापीय धारिता परिवर्तन आम तौर पर या तो सीधे निगरानी की जाती है (प्रत्यक्षcalorimetry के माध्यम से) या परोक्ष रूप से ओ 2 खपत और/या सह 2 उत्पादन (via respirometry) । दुर्भाग्य से, जब इन तकनीकों अलगाव में उपयोग किया जाता है, महत्वपूर्ण जानकारी ऐसे सेलुलर चयापचय के लिए anaerobic रास्ते के योगदान के रूप में खो दिया है । Calorespirometry एक शक्तिशाली तकनीक है कि दोनों गर्मी अपव्यय और श्वसन के समवर्ती माप पर निर्भर करता है । अग्रणी calorespirometric काम पूरी तरह से oxygenated स्तनधारी कोशिकाओं में anaerobic चयापचय की जांच की और दोनों एरोबिक और anaerobic रास्ते का एक साथ योगदान का प्रदर्शन ऊर्जा homeostasis में जा रहा है रूपांतरित कोशिकाओं के बावजूद एक पूर्णत: oxygenated वातावरण1. Calorespirometry के बाद से जैविक प्रश्नों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया गया है । कुछ उदाहरण कम ऑक्सीजन के स्तर पर पशु ऊर्जावान के अध्ययन में शामिल हैं, दोनों herbicide और bivalves के गिल पर एस्ट्रोजन के प्रभाव, स्थलीय जीवों के चयापचय, और कार्बनिक मिट्टी बात की माइक्रोबियल अपघटन2, 3 , 4 , 5 , 6. इसके अलावा, calorespirometry ठंड से पहले कैसे चयापचय कंडीशनिंग से पता चला है स्तनधारी कोशिकाओं7के cryopreservation में सुधार । प्रत्येक दृष्टिकोण, दोनों calorimetry और respirometry, स्वतंत्र रूप से सेलुलर और जीव के हमारे ज्ञान में वृद्धि हुई है । हालांकि, मौलिक जैविक सवाल है कि calorespirometry के उपयोग के माध्यम से उत्तर दिया जा सकता है अपेक्षाकृत बेरोज़गार रहते हैं ।
हेस के कानून में कहा गया है कि एक प्रतिक्रिया के कुल तापीय धारिता परिवर्तन प्रारंभिक और अंतिम राज्यों के बीच मार्ग से स्वतंत्र है । उदाहरण के लिए, एक जैव रासायनिक मार्ग के लिए कुल तापीय धारिता परिवर्तन मार्ग के भीतर सभी प्रतिक्रियाओं के enthalpies में परिवर्तन का योग है । Calorimetry सेलुलर गर्मी उत्पादन को मापने के लिए एक वास्तविक समय दृष्टिकोण प्रदान करता है, जो अंधाधुंध दोनों एरोबिक और anaerobic रास्ते का पता लगाता है । यह बुनियाद पर आधारित है कि प्रायोगिक एंपुल8की दीवारों के माध्यम से छोड़कर सिस्टम में कोई ऊर्जा का आदान-प्रदान नहीं किया जाता है । गर्मी अपव्यय में परिवर्तन एंपुल में सभी चयापचय प्रतिक्रियाओं से जारी तापीय धारिता में परिवर्तन के बराबर है । इस प्रकार, एक नकारात्मक तापीय धारिता प्रणाली से गर्मी की हानि के लिए संबद्ध । पिछले चार दशकों में व्यापक अनुसंधान दोनों catabolism और उपचय के ऊष्मा परिदृश्य विशेषता है । यह शोध लेख में एक स्थिर वृद्धि के द्वारा प्रतिनिधित्व किया है खोज शब्द “जैविक” और “calorimetry” के रूप में संयुक्त राज्य चिकित्सा के राष्ट्रीय पुस्तकालय (एनएलएम) द्वारा अनुक्रमित के रूप में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (PubMed) में । खोज से पता चलता है कि पहले १९७०, कुल 27 प्रकाशन संदर्भ जैविक calorimetry; इस बीच, २०१६ में अकेले, ५४६ प्रकाशन तकनीक का उपयोग किया ।
Calorimetric तरीकों को अच्छी तरह से गर्मी उत्पादन का निर्धारण स्थापित कर रहे हैं । हालांकि, और अधिक लचीलापन respirometric मान को हल करने के लिए दी गई है । respirometric माप ओ2, कं2, या दोनों हे2 और सह2से मिलकर कर सकते हैं । इसके अलावा, ओ2 या CO2 की माप विभिंन तकनीकों द्वारा पूरा किया जा सकता है, सहित optrodes, क्लार्क-प्रकार इलेक्ट्रोड, और स्वरित्र डायोड लेजर अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी7,9,10 ,11. जबकि सह2 उत्पादन कई respirometric अध्ययन में एक मूल्यवान मीट्रिक है, प्रसंस्कृत कोशिकाओं के लिए मध्यम अक्सर पीएच नियंत्रण12,13के लिए एक bicarbonic बफर प्रणाली का उपयोग करता है । बिकारबोनिट प्रणाली में सह2 माप की जटिलताओं से बचने के लिए, संस्कृति में कोशिकाओं के calorespirometry के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल एकमात्र respirometric पैरामीटर के रूप में2 ओ का उपयोग करता है ।
ऑक्सीजन प्रवाह को मापने के साथ समवर्ती, कुछ respirometers ( सामग्री की तालिकादेखें) mitochondrial समारोह के विस्तृत आकलन के लिए डिजाइन किए हैं । सब्सट्रेट-unयुग्मक-अवरोधक-titrations (सूट) प्रोटोकॉल अच्छी तरह से स्थापित कर रहे हैं और झिल्ली की क्षमता या प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) गठन14को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए प्रयोगों के साथ संगत कर रहे हैं । बरकरार कोशिकाओं के calorespirometry के लिए प्रस्तुत प्रोटोकॉल carbonyl साइनाइड-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) और f0f1-एटीपी सिंथेस अवरोधक oligomycin के रूप में रासायनिक युग्मकों की शुरूआत के साथ संगत है । FCCP के अलावा, ऑक्सीजन की खपत एटीपी उत्पादन है, जो mitochondrial peformance15पर संभावित चिकित्सीय उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए उपयोगी है से जोड़ा जा सकता है । इसके अलावा, oligomycin के अतिरिक्त लीक श्वसन की हद तक रोशन करती है । इस प्रकार, respirometric माप calorespirometry के दौरान प्रदर्शन व्यापक आगे स्पष्ट mitochondrial फिजियोलॉजी के लिए डिज़ाइन किया गया प्रोटोकॉल के साथ संगत कर रहे हैं ।
दोनों गर्मी अपव्यय और ऑक्सीजन फ्लक्स के एक साथ माप calorespirometric (सीआर) अनुपात की गणना के लिए अनुमति देता है । यह अनुपात तो है Thornton निरंतर या सैद्धांतिक oxycaloric समकक्ष, जो के बीच पर्वतमाला-४३० के लिए-४८० kJ मॉल-1 सेल लाइन या ब्याज की ऊतक और पूरक कार्बन सब्सट्रेट्स1पर निर्भर करता है की तुलना में, 16. इस प्रकार, एक और अधिक नकारात्मक सीआर अनुपात anaerobic रास्ते से समग्र चयापचय गतिविधि में वृद्धि हुई योगदान पता चलता है । उदाहरण के लिए, काम पर्वतमाला के सक्रिय प्रदर्शन के बिना नियमित मांसपेशी ऊतक श्वसन के लिए सीआर अनुपात-४४८ से-४६८ kJ मॉल-1 जो सैद्धांतिक oxycaloric समकक्ष की सीमा के भीतर है17,18. इस बीच, स्तनधारी कैंसर मध्यम है कि ग्लूकोज में उच्च है में प्रसंस्कृत कोशिकाओं प्रदर्शन बढ़ाया लैक्टिक एसिड किण्वन glycolysis और अपेक्षाकृत कम mitochondrial सगाई के बाद19। इस phenotype में सीआर अनुपात में परिणाम-४९० से-८०० kJ मॉल-1, सेलुलर चयापचय में anaerobic मार्ग के एक बढ़ भागीदारी का प्रदर्शन के रूप में और अधिक नकारात्मक सीआर अनुपात द्वारा संकेत दिया है1,7, 16,20.
वाणिज्यिक और गैर लाभ सेल और ऊतक वितरकों दोनों वर्तमान में १५० से अधिक प्रजातियों से सेल लाइनों की पेशकश, लगभग ४,००० कोशिकाओं को मनुष्यों से व्युत्पंन लाइनों के साथ । अमर कोशिका लाइनों जल्दी से संभावित चिकित्सकीय की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए सुविधाजनक उपकरण हैं, जिनमें से कई प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से mitochondrial कार्यों के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । दवा स्क्रीनिंग के दौरान रूपांतरित कोशिकाओं का उपयोग करना Warburg प्रभाव, कई कैंसर की एक बानगी के भाग में सीमित भविष्यवाणी मूल्य का हो सकता है । अक्सर, कैंसर सब्सट्रेट स्तर फास्फारिलीकरण से एटीपी उत्पन्न और पूरी तरह से एरोबिक शर्तों के तहत mitochondrion को उलझाने के बिना स्तनपान के उत्पादन के माध्यम से redox संतुलन बनाए रखने19. दवा विकास बेहद महंगा है और अक्षम है, लगभग 9 से बाहर 8 मानव नैदानिक परीक्षण में परीक्षण के लिए बाजार की मंजूरी प्राप्त करने में विफल यौगिकों21। जबकि संभावित चिकित्सकीय सेल लाइनों में कम cytotoxicity के कारण प्रारंभिक स्क्रीनिंग पारित हो सकता है, यह संभव है कि इन यौगिकों के कुछ mitotoxic हैं । एक उपयुक्त विधि के बिना पता लगाने के लिए कैसे इन विषाक्त पदार्थों को प्राथमिक कोशिकाओं है कि Warburg प्रभाव प्रदर्शित नहीं करते में ऊर्जा संतुलन ख़राब कर सकते हैं, महत्वपूर्ण जानकारी अक्सर है पर देखा, प्रारंभिक अवस्था में चिकित्सीय विकास अड़चन ।
Calorespirometry कोशिकाओं और ऊतकों सहित जैविक नमूनों की एक किस्म में चयापचय गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक व्यावहारिक, इनवेसिव दृष्टिकोण है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल के कोर आवेदनों की एक सीमा के साथ संगत है । एक जटिलता, तथापि, की पहचान की गई है । अमर कोशिकाओं को अक्सर एक ग्लूकोज मुक्त मध्यम ऊर्जा उत्पादन के लिए ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण (OXPHOS) के योगदान को बढ़ाने के लिए गैलेक्टोज के साथ पूरक में संस्कृति रहे हैं, क्रम में संभावित mitotoxins करने के लिए कोशिकाओं को संवेदनशील करने के लिए22, 23. इस चयापचय reprogramming जब नमूने स्टेनलेस स्टील कैलोरीमीटर द्वारा इस्तेमाल किया ampules में रखा जाता है अस्पष्ट विश्लेषण करने के लिए प्रकट होता है15। एक ग्लूकोज माध्यम में प्रसंस्कृत कोशिकाओं कई घंटे के लिए उच्च चयापचय गतिविधि में संलग्न करने के लिए जारी. इस बीच, गैलेक्टोज माध्यम में प्रसंस्कृत कोशिकाओं एंपुल में अपने स्थान के 30 मिनट के भीतर गर्मी उत्पादन में कमी, माप जल्दी प्रयोगात्मक समय अंक के लिए प्रतिबंधित कर रही है । यह व्यवहार दुर्भाग्यवश, उनके सेलुलर प्रसार का आकलन करने के अवसर में बाधा डालता है । इस विशिष्ट सीमा के बावजूद, सबसे अनुप्रयोगों calorespirometric विश्लेषण और विस्तृत चयापचय जानकारी के साथ संगत इस दृष्टिकोण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
calorespirometry के उद्देश्य के लिए मात्रात्मक को चयापचय गतिविधि के लिए एरोबिक और anaerobic रास्ते के योगदान का मूल्यांकन और सेलुलर ऊर्जा प्रवाह का एक समग्र दृष्टिकोण प्राप्त है । यह गर्मी अपव्यय और ऑक्सीजन प्रवाह सै…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के हिस्से में राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रांट चे-१६०९४४ मरियम ई. Konkle और माइकल ए Menze के द्वारा वित्त पोषित किया गया ।
Materials
| HepG2 Cells | American Type Culture Collection | HB-8065 | Cells used for calorespirometry |
| O2k-Respirometer | Oroboros Instruments | 10022-02 | Respirometer |
| LKB 2277 thermal activity monitor (TAM) | Thermometric AB | Thermometric was purchased by TA Instruments | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermofisher Scientific | 11360070 | 100x solution added to DMEM medium |
| Fetal Bovine Serum – Premiuim Select | Atlanta Biologicals | S11550 | Added to 10% in DMEM medium |
| Trypsn-EDTA (0.25%) | Thermofisher Scientific | 25200072 | Cell dissociation reagent |
| Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes | Sigma Aldrich | O4876 | Mitochondrial Inhibitor |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma Aldrich | C2920 | Mitochondrial Uncoupler |
| Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning Corporation | 430167 | Tissue culture dish |
| Glucose, powder | Thermofisher Scientific | 15023021 | Glucose for DMEM medium |
| Galactose, powder | Fischer Scientific | BP656500 | Galactose for DMEM medium |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermofisher Scientific | 25030081 | Glutamine for DMEM medium |
| DMEM, no glucose | Thermofisher Scientific | 11966025 | Cell culture medium |
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