本文介绍了一种简单的细胞分馏方案，用于分离人新鲜及冷冻肠道活检组织中的胞质蛋白和核蛋白。
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本文内容
摘要
摘要
本方案的目的是将通过内窥镜获取的人类肠道组织分馏为细胞核和细胞质组分，以分析特定蛋白质或蛋白质复合物在不同组织状态（即健康与疾病）下的定位情况。该方法适用于新鲜及冷冻肠道组织样本的分馏，操作简便，所有实验室均可开展，且耗时较少。
引言
蛋白质几乎参与细胞内的所有生物学功能，其结构、数量或位置的任何变化都可能导致致病情况。组织样本分馏方法有助于降低与疾病相关蛋白质分析的复杂性。一些研究利用蛋白质定位信息或富集特定细胞区室中的蛋白质，因此建立一种可重复地分离完整蛋白质的方案，对于回答特定生物学问题具有重要意义。确定蛋白质的亚细胞定位，并监测其在基础状态和疾病状态下的区室重新分布或相互作用，将有助于识别与疾病相关的功能差异1，2。因此，本方法旨在对新鲜或冷冻的肠道组织活检样本进行可重复的分馏，将其分离为细胞质和细胞核两个亚细胞组分。
在内镜检查过程中常规获取肠道活检样本3（图1），这些样本可有效用于蛋白质定量或免疫共沉淀研究。由于来自肠上皮的组织样本含有可能直接参与疾病发病机制的蛋白质4，因此肠道活检样本是成功鉴定肠道疾病特异性蛋白质的宝贵来源。将患者组织样本连同临床信息一起冷冻保存，可为蛋白质分析提供有用的资源，而利用有限量的冷冻组织获得细胞区室信息的关键在于简单且可重复的样本制备方法5。
目前市面上有多种可用于分离细胞组分的商业试剂盒，但这些试剂盒通常比本文所述方....
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方案
本研究经克鲁塞斯大学医院伦理委员会批准，并在获得所有受试者或其监护人的知情同意后进行分析。
1. 活检样本采集
注意：患者远端十二指肠的活检样本是在常规诊断性内镜检查过程中获取的，所获取的活检组织重量通常在 2 至 10 mg 之间。活检组织是一种由多种细胞类型组成的复杂组织，包括上皮细胞、免疫细胞和内皮细胞。临床胃肠病医生依据既定的临床指南进行内镜操作。
- 内镜检查后立即将活检组织置于无菌滤纸上。
- 使用镊子将活检组织转移至1.5 mL离心管中，用PBS浸泡后放入冻存管中。
- 将离心管置于冰上，直至送达实验室。
- 立即开始处理新鲜活检组织。
- 对于冷冻活检组织，需将含有组织的离心管进行速冻，并储存在液氮中直至使用。
注意：在加入冷补充缓冲液1之前，必须始终保持样本处于冷冻状态。
2. 缓冲液的配制
注意：开始之前，按如下说明补充缓冲液。
- 向低渗缓冲液1和高渗缓冲液2（表1）中加入1 mM DTT（终浓度）以及蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（终浓度1×）。
- 每份样品准备1.5 mL缓....
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结果
图1 显示一段肠活检切片的苏木精-伊红染色结果，可见完整的绒毛和隐窝结构。
使用本方案进行细胞核与细胞质分馏的代表性结果如图2和图3所示。在图2所示实验中，一份新鲜（Fh）和一份冷冻（Fz）的活检组织同时按照本方案进行分馏，并对每份样品取20 μg进行Western blot分析。表2列出了各组分及活检组织中的蛋白浓度，新鲜与冷冻组织之间的蛋白浓度差异不大。从2 mg活检组织中提取的蛋白产量在细胞质组分中约为3–4 µg/µL，在细胞核组分中约为1.5 µg/µL。为检测各组分纯度，使用HSP90和微管蛋白（tubulin）作为细胞质对照，HDAC1和H3作为细胞核对照13。可见HSP9.......
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讨论
本文所述方案用于肠道活检组织的细胞核与细胞质组分分离。所获得的纯化蛋白未发生变性，不仅可用于蛋白质印迹分析（如图 2和3所示），还可用于需要天然折叠蛋白的实验，例如免疫沉淀、电泳迁移率变动分析（EMSA）或非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
该方法依赖于组织的机械匀浆结合渗透裂解，以破坏细胞膜而不影响核膜。其结果是实现细胞质蛋白和核蛋白的有效分离，可用于后续分析。在操作过程中，必须通过添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂来控制蛋白质的降解。此外，如果提取的蛋白质将用于后续功能检测，则还必须避免样品发生变性或蛋白水解。所有操作应在 4 °C 下进行，且缓冲液中也应加入 PMSF。
本方案中描述的操作步骤简单且经济实惠，样品处理时间极短。本方案不受处理时间过长和使用昂贵的组分分离试剂盒等问题的限制。
新鲜和冷冻的组织活检均可用于本方案，其中冷冻活检可获得较为纯净且可重复的组分分离结.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Ander Lopez和Miren Telletxea在视频录制与编辑方面提供的协助。ACR由Ikerbasque基金会项目及马德里乳糜泻协会（ACM）的研究项目资助。JRB由ISCIII-PI16/00258项目资助，并由欧洲联盟区域发展基金（ERDF）/欧洲社会基金（ESF）“迈向欧洲之路”计划共同资助。IS由巴斯克卫生部研究项目资助（项目编号：2015111068）。IRG和AJM分别获得巴斯克大学（UPV/EHU）和巴斯克教育部的博士前奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-1kg | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333-1kg | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 5588886-1kg | |
| DTT | Sigma Aldrich | 10197777001 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo Scientific | A32959 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | CA-630 | 去垢剂 |
| BCA 法检测试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 | 蛋白质定量试剂盒 |
| 一次性塑料研磨棒 | Sigma Aldrich | Z359947-100EA | |
| 达恩斯玻璃匀浆器 | VWR | 431-0100 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5415-R | |
| 振荡器 | IKA | MS3 basic |
参考文献
- Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).
- Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. Global, quantitative and ....
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重印与许可
