Protokoller er beskrevet for vurderingen af toksicitet af kemi til umodne og voksne myg for udvikling som nye klasser af larvicides, adulticides og endectocides. Protokollerne aktiverer høj overførselshastighed afprøvning af flere kemi på single-point dosis og efterfølgende evaluering via dosis svar analysen til bestemmelse af toksicitet på kontakt eller via indtagelse.
Nye klasser af insekticider med nye former for handling er nødvendig for at styre insekticid resistente bestande af myg, som overfører sygdomme som Zika, denguefeber og malaria. Assays til hurtige, høj overførselshastighed analyser af uformulerede roman kemi mod myg larver og voksne er præsenteret. Vi beskriver protokoller for enkelt punkt-dosis og dosis svar assays til at evaluere toksicitet af lille molekyle kemi Aedes aegypti vektor Zika, denguefeber og gul feber, malaria vektor, Anopheles gambiae og den nordlige House myg, Culex quinquefasciatus, på kontakt og via indtagelse. Som et eksempel evalueret vi toksiciteten af amitriptylin, et lille molekyle antagonist i G protein koblede receptorer, via larve, voksen aktuel og voksne blod-fodring assay. Protokollerne giver et udgangspunkt for at undersøge insekticid potentielle. Resultaterne drøftes i forbindelse med yderligere eksperimenter for at udforske produkt programmer og mekanismer til levering.
Myg overføre smitsomme sygdomme, der påvirker menneskers sundhed globalt agenser1. De tre vigtigste myg slægter der påvirker menneskers sundhed er Aedes, Anopheles, og Culex. Arter af Aedes myg vektor de arboviruses, der forårsager Zika, denguefeber, gul feber og chikungunya. Anopheles arter vektor malariaparasitter og Culex arter overfører West Nile virus og filarial nematoder2. Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har opfordret til udryddelse af ti oversete tropiske sygdomme (NTD) af 20203 og identificeret myggekontrol som den mest bæredygtige strategi. Insekticider er kraftfulde værktøjer til at styre myg og reducere sygdom transmission4,5. Dog, fremkomsten af insekticid-resistente mosquito befolkninger truer fortsat bekæmpelse af mange sygdomme6,7,8. Innovative vektor kontrol Consortium (IVCC) har lanceret den første dedikerede indsats at udvikle udskiftning insekticider for myg kontrol9. Nye insekticider med nye former for action (MoA) er nødvendige for at opfylde der mål og opnå sygdomsbekæmpelse. Opdagelse og udvikling af nye insekticid klasser med romanen MoAs kræver hele organismen assays for hurtige, høj overførselshastighed analyse af kemi og i forhold til branchens standarder10.
Flere assays er tilgængelige til at evaluere frastødning og toksicitet af insekticider til larver og voksne myg, og nogle er velegnede til evaluering af roman formuleret eller uformulerede kemi. WHO protokol11 er en kontakt analysen bruges til at teste produkter mod fjerde instar larver. Offentliggjorte undersøgelser også beskrive en række larve assays bruges til at teste toksicitet af lille molekyle kemi til larver af Aedes aegypti, Anopheles gambiae og Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. Centers for Disease Control og forebyggelse (CDC) flaske bioassay bruges til at vurdere insekticidresistens i feltet fanget populationer af voksne myg via evaluering af dødelig koncentration (LC) og letale tid (LT) i forhold til en standard diagnostiske dosis af en kommerciel insekticid17. WHO modtagelighed test tilbyder en anden tilgang til at vurdere insekticidresistens hos voksne myg hvorved myg er udsat for insekticid-imprægnerede papir inde i hætteglas til 1t og dødelighed er vurderet på 24 h18. Andre assays spray formuleringer inde i forseglet bure og optage myg knockdown og død på ønskede timepoints19. Lokal applikation til myg thorax er blevet brugt til at vurdere styrken af forskellige pesticider20. Liverpool insekt test etablering (LITE)21 beskæftiger standardforskriftertil at vurdere bioactivity af kemi til voksne myg. LITE voksen aktuel analysen gælder en lille mængde af prøveproduktet thorax af voksne myg med dødelighed scorede på 48 timer. Analysen giver mulighed for kvantificering af den dosis, der modtages pr. enkelte myg21. LITE tarsal analysen evaluerer toksiciteten af prøveproduktet til voksne myg hvilende på en kemisk behandlede overflade og bruges til at identificere kemi med udviklingspotentiale som indendørs resterende sprays (IRS) eller bruge i insekticid behandlet myggenet (ITNs) til at styre Anopheles myg.
WHO og CDC assays har begrænsninger for afprøvning roman, uformulerede kemi, og målet med CDC flaske bioassay er evaluering af modtagelighed over korte assay perioder (to timer) i stedet for toksicitet22,23. Derudover assays til evaluering af toksicitet af kemi leveret i blodmel og potentiale for udvikling af systemisk virkende produkter (dvs. endectocides) mangler. Her beskriver vi assays til test mosquitocidal aktivitet af roman kemi, der er opløseligt i vand eller en af flere organiske opløsningsmidler mod larver og voksne af Aedes, Anopheles og Culex. Først skal vi vise en larve assay tidligere beskrevet af vores gruppe10,12,13,16, og udført her som (1) en raster hastigt evaluere flere kemi på ét enkelt sted dosis, og (2) en dosis svar assay til at bestemme den dødelig koncentration (fx LC50, LC75 eller LC90,) af en enkelt kemi. Næste, vi beskriver to voksne assays til bestemmelse af dødelige dosis (LD). Først af disse er en tilpasning af den LITE protokol for afprøvning af topikalt, Roman kemi mod voksne myg i forhold til en positiv kontrol. Andet er en fodring assay for evaluering af kemi leveret systemisk via blod måltid.
Insekticider er kraftfulde værktøjer til bekæmpelse af myg-bårne sygdomme som malaria25, denguefeber og Zika26. Omfattende insekticid brug har produceret mosquito befolkninger, er modstandsdygtige over for kemisk bekæmpelse, fører til udviklingen af insekticidresistens, som anses for den enkelte største trussel mod fortsatte sygdomsbekæmpelse. Det sidste tiår er sket en dramatisk stigning i populationer af Anopheles spp. resistente over for syntetiske pyrethroider (SPs) anvendes i myggenet i Afrika7. Populationer af Aedes albopictus, en vektor af dengue og Zika, er blevet rapporteret i Florida og New Jersey der er resistente over for organofosfater6. På samme måde, modstand mod DDT og pyrethroider er blevet dokumenteret i populationer af Anopheles og Aedes spp. i Colombia27,28. Der er presserende behov for at udvikle nye larvicides og adulticides, der binder til forskellige orthosteric eller allosteriske websteder på kendte molekylære mål eller at forstyrre nye mål (dvs. roman MoA kemi)29,30 og har minimal miljøpåvirkning. Der også stigende anerkendelse af potentiale omkring endectocides for myg kontrol31,32,33.
For at lette den hurtige udvikling af sådanne produkter, beskriver vi en række protokoller, designet til at evaluere toksicitet af lille molekyle kemi til myg larver og voksne via to levering ruter – kontakt og indtagelse. Protokoller såsom WHO modtagelighed test og CDC flaske assay er til fælles brug for evaluering af toksicitet og frastødning af eksisterende insektbekæmpelsesmidler formuleringer1,2. Men disse assays har begrænsninger for analyser af uformulerede roman kemiske enheder (NCEs) og er ikke indstillet til test af stort antal kemi i moderat eller høj overførselshastighed.
Her beskriver vi en standard larve assay du kan hurtigt vurdere NCEs i enkelt dosis, der kan skaleres til høj overførselshastighed analyser. Vi beskriver også en tilpasning af en analyse, der er udviklet af den LITE21 at vurdere kontakt toksicitet af lille molekyle kemi til voksne myg. Endelig vil vi beskrive en indtagelse assay for at evaluere toksicitet af NCEs leveret via blod måltid til voksne kvindelige myg og udforske endectocide potentiale. Disse larve og voksen assays kan udføres på en række doser for at bestemme LC og LD værdier, henholdsvis, og både larve og voksen kontakt assays kan udføres i forhold til en eller flere eksisterende kemiske formuleringer. Den voksne aktuel analyse giver også mulighed for beregning af LD værdier pr. enkelte myg. Protokollerne kan udføres ved hjælp af arter af Aedes, Anopheles og Culex16,29 og kan blive ændret for at imødekomme de specifikke biologiske egenskaber af en art, hvis det ønskes. Vores erfaring, mosquitocidal kemi typisk udviser bred aktivitet på tværs af disse tre slægter16,29, men der er værdi til vurdering af arter selektivitet.
Assays er udgangspunktet for hurtigt skærmen flere kemi for insekticide aktivitet. Disse kemi, der udviser toksicitet i en eller flere assays kunne vælges for yderligere analyser via sekundær og tertiær assays. Eksempler omfatter LITE tarsal assay og sukker fodring assays34,35. Udvælgelse af yderligere assays bestemmes typisk ved overvejelser omkring forventede markedet og anvendelse, med resultater giver indsigt til mulige produkt levering tilstande. I de repræsentative resultater vist her, undersøge vi toksiciteten af amitriptylin, en antagonist af pattedyr og hvirvelløse dopamin receptorer, der er blevet evalueret for potentiale som en roman MoA insekticid10,12, 13 , 16. amitriptylin udstillet toksicitet for larver og voksne af Ae. aegytpi i μg udvalg foreslår larver og adulticidal aktivitet og giver begrundelsen for en udforskning af en amitriptylin-baserede kemiske serien til at identificere analoger med høj potens. Ingen signifikant effekt på dødelighed eller frugtbarhed blev observeret i Ae. aegypti udsat for amitriptylin i blod måltid. Mens stabilitet af kemi i defibrinated blod og effektiv dosis modtaget pr. myg ikke er kendt, bemærkelsesværdige begrænsninger af analysen, data tyder på at amitriptylin og andre GPCR-aktive forbindelser kan have lidt potentiale som endectocides, på mindst i uformulerede tilstand.
Forholdsregler for at begrænse biologiske variation mellem assays er afgørende. Alle assays skal udføres under standardbetingelser for temperatur og fugtighed, helst i en insekt vækst, for at sikre reproducerbarhed. Det er bydende nødvendigt at standardisere procedurer for scoring fænotypiske punkter, da disse kan være meget subjektiv, fører til betydelig variation i data registreret ved forskellige laboratoriepersonalet. Larve analysen er bedst egnet til evaluering af kemi, der er opløseligt i vand, selv om analysen kan udføres ved hjælp af organiske opløsningsmidler som DMSO, forudsat at det endelige koncentration er mindre end 1% pr. brønd. Vi genkender flere begrænsninger til den voksne aktuel assay. Først, det er nødvendigt at arbejde hurtigt, når du forbereder serielle fortyndinger og levere doser som carrier (acetone) er yderst flygtig og fordampning kan producere variation i mængden af kemi leveret. For det andet bør pleje tages til at sætte en frist for anæstesi, da dette kan bidrage til dødelighed. Det skal også bemærkes, at opløsningsmidler som acetone kan producere en hurtig “knock-down”-effekt i de første mange timer af den aktuelle analyse, som ikke bør forveksles med virkninger som følge af test-kemi. Vi bemærker, at omfanget af blodmel myg varierer mellem individer, kompliceret en vurdering af den dosis, der modtages pr. voksen i voksen indtagelse assay. Endelig bør assay data ikke betragtes i tilfælde hvor dødelighed i den negative kontrol overstiger 10%.
Produkter, der handle synergistisk er i stigende grad anerkendt for deres potentiale til at udvide nytten af eksisterende produkter og give kontrol af insekticid resistente skadedyr populationer15,16,36. Larve assays har været brugt til at undersøge synergi mellem formamidine pesticid, amitraz og en bred vifte af kemi, der forstyrrer hvirvelløse octopamine receptorer14,15. Larve assay og voksen aktuel assay beskrevet er velegnede til evaluering synergistisk eller tilsætningsstof virkninger mellem kombinationer af test-kemi. Vi noterer os, synergister som piperonyl butoxid (PBO) kan integreres i hver af de tre undersøgelser, som beskrevet her.
De ovenfor beskrevne assays give en standardiseret eksperimentelle serie for evaluering af uformulerede, lille molekyle lægemidler mod vandlevende og jordbaserede myg livsstadier. Disse assays er specielt designet til at evaluere toksicitet og tilbyder flere fordele i forhold til eksisterende undersøgelser til fælles brug. Vigtigere er, assays er indstillet til automatisering og kan udføres i industriel skala hen til muliggøre evaluering af tusindvis af test forbindelser. Endelig, som feltet anser udviklingen af produkter, der fungerer via nye MoAs, herunder via afbrydelse af roman molekylære mål og biokemiske veje, vil det være afgørende at score flere fænotypiske slutpunkter ud over dem som dødelighed og lammelse. De ovenstående assays tillade sådanne undersøgelser, hvilket giver et skridt på vejen mod morgendagens højinnovative insektbekæmpelsesmidler teknologier.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke H. Ranson, Liverpool School of Tropical Medicine for støtte med assay udvikling og levering af LITE-protokollen, og M. Scharf, Purdue University for rådgivning vedrørende analyse design.
Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | – | Tool needed for topical application experiments |
24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | – |
Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | – | Used to seal the paper cups |
Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
Tulle fabric, white | Walmart | – | – |
Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | – | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
Tweezers (fine) | Fontax | – | Used to handle adult mosquitoes |