सीटू संकरण प्रोटोकॉल में यह एकल अणु प्रतिदीप्ति वनस्पति विकास और अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान नवोदित खमीर में आरएनए अणुओं की संख्या को यों तो अनुकूलित है ।
एकल अणु प्रतिदीप्ति में सीटू संकरण (smFISH) एक शक्तिशाली तकनीक का पता लगाने और व्यक्तिगत आरएनए अणुओं की गणना करने की क्षमता के कारण एकल कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए है. गहन अनुक्रमण आधारित तरीकों के पूरक, smFISH प्रतिलिपि में सेल-टू-सेल भिन्नता के बारे में जानकारी प्रदान करता है और एक दिया आरएनए के उपसेलुलर स्थानीयकरण. हाल ही में, हम smFISH का इस्तेमाल किया है नवोदित खमीर में अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान जीन NDC80 की अभिव्यक्ति का अध्ययन, जिसमें दो प्रतिलिपि isoforms मौजूद है और कम प्रतिलिपि isoform अपने पूरे लंबे isoform के साथ साझा अनुक्रम है । के लिए आत्मविश्वास से प्रत्येक प्रतिलिपि isoform की पहचान, हम smFISH प्रोटोकॉल ज्ञात अनुकूलित और उच्च संगति और smFISH डेटा की गुणवत्ता के लिए उभरते खमीर अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान अधिग्रहीत नमूनों के लिए प्राप्त की । यहां, हम इस अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन, मानदंड है कि हम smFISH डेटा की उच्च गुणवत्ता प्राप्त की है कि क्या यह निर्धारित करने का उपयोग करें, और अंय खमीर उपभेदों और विकास की स्थिति में इस प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए कुछ सुझाव ।
जीन अभिव्यक्ति के गतिशील विनियमन एक जीव के विकास ड्राइव, के रूप में अच्छी तरह से पर्यावरण तनाव, संक्रमण के लिए अपनी प्रतिक्रिया के रूप में, और चयापचय में परिवर्तन । transcriptional विनियमन पर ध्यान केंद्रित अध्ययनों कि आरएनए बहुतायत को मापने प्रौद्योगिकियों पर भरोसा करते हैं । ऐसा ही एक तरीका है, सीटू संकरण (smFISH) में एकल अणु प्रतिदीप्ति, एकल कोशिकाओं1,2में व्यक्तिगत आरएनए अणुओं का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस विधि से कोशिका के लिए कोशिका परिवर्तनशीलता जीन अभिव्यक्ति और intracellular आरएनए स्थानीयकरण के निर्धारण में माप की अनुमति देता है.
सबसे अधिक इस्तेमाल किया smFISH तकनीक में, एक व्यक्ति आरएनए अणु का पता लगाने के कई छोटे डीएनए जांच की आवश्यकता है (अक्सर ~ ४८ २०-मेर जांच) कि लक्ष्य आरएनए के पूरक हैं और एक ही फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए संयुग्मित हैं. कमजोर संकेत में एक एकल फ्लोरोसेंट जांच के परिणाम के बंधन, लेकिन सभी जांच के पहनावा से संकेत मजबूत है । यह सुविधा बहुत सिग्नल से शोर अनुपात में सुधार क्योंकि भले ही एक जांच बंद लक्ष्य बंधन प्रदर्शन कर सकते हैं, ऐसे संकेत लक्ष्य आरएनए अणु की तुलना में बहुत कमजोर होने की उम्मीद है3. पता लगाने की त्रुटि के भीतर, आरएनए अणुओं की संख्या गिना जा सकता है और विभिंन विकास की स्थिति में और विभिंन म्यूटेंट के बीच की तुलना में ।
अपनी पहली विकास के बाद से, smFISH4, जैसे प्रतिलेखन बढ़ाव1,2, ब्याह5,6, transcriptional फट7 के रूप में जीन अभिव्यक्ति के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया गया है , 8 , 9, intracellular allelic अभिव्यक्ति10,11,12, और आरएनए स्थानीयकरण13,14,15. हाल ही में, हम इस पद्धति का इस्तेमाल किया है एक ही जीन के दो प्रतिलिपि isoforms की अभिव्यक्ति का अध्ययन, जिसमें लघु प्रतिलिपि isoform (NDC80ओआरएफ) अपने पूरे लंबे isoform के साथ साझा अनुक्रम है (NDC80लुटि )16. अद्वितीय रूप से दो mRNA isoforms की पहचान करने के लिए, हम दो जांच सेट का इस्तेमाल किया: एक सेट NDC80लुटिके अद्वितीय अनुक्रम के लिए विशिष्ट है, और अन्य सेट, एक और फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए संयुग्मित, दो isoforms के आम क्षेत्र के लिए बाइंड कर देता. NDC80लुटि आरएनए दोनों फ्लोरोसेंट संकेतों के साथ एक colocalized स्थान के रूप में पहचान की है, जबकि NDC80ओआरएफ आरएनए एक है कि आम जांच सेट से केवल संकेत होता है । के बाद से NDC80ओआरएफ टेप की संख्या एक “घटाव” विधि द्वारा गणना की है, जांच संकरण की उच्च दक्षता और एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात के लिए आत्मविश्वास से smFISH धब्बे की पहचान और त्रुटि को कम करने के लिए आवश्यक हैं प्रोपेगेशन.
यह कागज नवोदित खमीर Saccharomyces cerevisiaeमें smFISH प्रदर्शन के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल में, कक्ष संख्या, निर्धारण समय, पाचन समय, पाचन बफर, जांच एकाग्रता, और smFISH प्रयोगों के लिए इस्तेमाल संकरण बफर एस cerevisiae के दौर से गुजर वनस्पति के SK1 तनाव पृष्ठभूमि के लिए अनुकूलित किया गया वृद्धि या अर्धसूत्रीविभाजन । हालांकि, हम भी इस पांडुलिपि में ध्यान दें: (1) विधि छवि अधिग्रहण के बाद smFISH डेटा की गुणवत्ता की जांच करने के लिए, और (2) प्रोटोकॉल है कि अलग तनाव पृष्ठभूमि और विकास की स्थिति के लिए अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती में कदम ।
प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत अंय प्रकाशित smFISH प्रोटोकॉल से व्युत्पंन है2,3,21,22,23, और विशेष रूप से खमीर तनाव पृष्ठभूमि SK1 के लिए अनुकूलित है । अनुकूलित पैरामीटर कक्ष संख्या, निर्धारण की अवधि, केंद्रापसारक गति और अवधि, पाचन अवधि, पाचन बफर, जांच एकाग्रता, और संकरण बफर शामिल थे । ऐसे संकरण तापमान और अवधि के रूप में अंय मानकों को अनुकूलित नहीं थे । इस अनुभाग में, हम कुछ नोट है कि किसी भी खमीर तनाव पृष्ठभूमि और ब्याज की वृद्धि की स्थिति के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन में मदद मिलेगी साझा करें ।
उभरते खमीर के सेल दीवार एक बड़ी चुनौती है नवोदित खमीर में उच्च गुणवत्ता smFISH छवियों को प्राप्त करने के खिलाफ है क्योंकि सेल दीवार जांच प्रवेश रोकता है । zymolyase द्वारा सेल दीवार के अपूर्ण पाचन जांच और उच्च कोशिका के लिए संकेत में सेल परिवर्तनशीलता के अकुशल संकरण की ओर जाता है । हालांकि, अधिक पाचन कोशिकाओं को भी कमजोर कर सकते हैं, महत्वपूर्ण सेल नुकसान के लिए अग्रणी धोने के कदम और सेल इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयार करने के दौरान फोड़ के दौरान । इस प्रकार, पाचन की अवधि का अनुकूलन महत्वपूर्ण है । हम समय की विभिंन मात्रा के लिए एक ही नमूना पचा द्वारा एक पायलट smFISH प्रयोग आयोजित करने की सलाह देते हैं । हमारे मामले में, हम सबसे अच्छा smFISH डेटा प्राप्त अगर हम पाचन बंद कर दिया जब ~ ८०% कोशिकाओं के गैर अपवर्तन बन गया । आमतौर पर, एक ही वृद्धि की स्थिति के लिए, अलग आनुवंशिक उत्परिवर्ती उपभेदों समान समय के साथ पचा जा सकता है । हालांकि, पाचन की अवधि अलग है जब विभिंन विकास की स्थिति और नवोदित खमीर में अर्धसूत्रीविभाजन के विभिंन चरणों के बीच तुलना में । एक बार समय निर्धारित किया जाता है, smFISH की गुणवत्ता reproducible है । नोट कि दोषपूर्ण कोशिका दीवार संश्लेषण और/या संरचना के साथ उत्परिवर्ती उपभेदों के लिए, पाचन से कम 15 मिनट में पूरा किया जा सकता है । zymolyase के विभिंन बैचों का उपयोग भी थोड़ा पाचन समय बदल सकता है ।
इष्टतम जांच एकाग्रता के लिए एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात को प्राप्त करने की जरूरत है । हम डिजाइन और व्यावसायिक रूप से हमारे smFISH जांच खरीदा है । अच्छी जांच (अक्सर 20-mers) ३५% से ४५%, जांच के बीच 2 आधार जोड़े की एक ंयूनतम रिक्ति को लेकर GC का एक प्रतिशत होना चाहिए, और कम पार-जेट । हम जांच की एक सूची उत्पंन करने के लिए निर्माता से एक वेब आधारित जांच डिजाइनर का इस्तेमाल किया, और अगर वहां पर्याप्त जांच से चुनने के लिए, हम Saccharomyces जीनोम डाटाबेस में विस्फोट एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए 17 से अधिक आधार जोड़े के साथ जांच समाप्त होगा अंय जीनोमिक क्षेत्रों के साथ । हम जांच सेट के लिए अधिक photostable फ्लोरोसेंट डाई (काल Fluor ५९०) चुना है कि anneals के अद्वितीय क्षेत्र के लिए NDC80लुटि (CF ५९०) क्योंकि इस सेट में, जांच की संख्या है कि उपरोक्त मानदंडों के सभी संतुष्ट (20 जांच) से कम था निर्माता द्वारा अनुशंसित न्यूनतम संख्या (~ 25 जांच). निर्माता के निर्देशों के बाद जांच समाधान का पुनर्गठन करने के बाद, हम शेयर समाधान के एक 1:10 कमजोर पड़ने बनाया है और 5 में पतला समाधान-µ एल aliquots में संग्रहित-20 ˚ सी । प्रत्येक aliquot का उपयोग केवल एक बार किया गया । अनुकूलन के लिए, एक 1:10 पतला समाधान और परीक्षण जो एकाग्रता सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात पैदावार से धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाना चाहिए । हम मूल शेयर से 1:250, 1:500, 1:1000, और 1:2000 की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाने की सलाह देते हैं । हमारे मामले में, एक 1:500 कमजोर पड़ने का कारक सबसे अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात के परिणामस्वरूप, दोनों CF ५९० और Q ६७० जांच सेट के लिए ।
इष्टतम निर्धारण समय नवोदित खमीर में सफल smFISH के लिए भी महत्वपूर्ण है । हमने पाया है कि 4 ˚ सी पर रात निर्धारण, बजाय 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर फिक्सिंग, काफी स्थिरता और meiotic नमूनों के लिए smFISH परिणामों की गुणवत्ता में सुधार । हालांकि हम परीक्षण नहीं किया है कैसे रातोंरात निर्धारण वनस्पति नमूनों प्रभाव हो सकता है, कमरे के तापमान पर निर्धारण इस वृद्धि की स्थिति के लिए अच्छी तरह से काम किया । इस प्रकार, नए उपभेदों या विकास की स्थिति के लिए smFISH प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए, हम सुझाव है कि कमरे के तापमान पर कम निर्धारण समय के साथ शुरू करने और निर्धारण समय में वृद्धि अगर संकेत की उच्च परिवर्तनशीलता का सामना करना पड़ा है ।
अन्य प्रकाशित प्रोटोकॉल के साथ तुलना में3,22,23, हमारे प्रोटोकॉल पाचन के दौरान RNase अवरोधक VRC का उपयोग करता है और संकरण के दौरान VRC के एक उच्च एकाग्रता. इन दो चरणों में VRC के अलावा smFISH परिणामों की निरंतरता में सुधार, संभवतः बेहतर nuclease गतिविधि है, जो zymolyase मिश्रण द्वारा पेश किया जा सकता है के खिलाफ आरएनए अणुओं के संरक्षण द्वारा (एंजाइम कच्चे तेल के अर्क से शुद्ध है और शामिल हो सकते हैं RNase संदूषण) । इस प्रकार, हम VRC की राशि का उपयोग करने की सिफारिश के रूप में हमारे प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध या अनुकूलन के लिए VRC के भी उच्च सांद्रता ।
दोनों बफ़र B और formamide वॉश बफ़र में वाशिंग चरणों के दौरान कक्षों का एक महत्वपूर्ण भाग खो सकते हैं । कोशिका हानि को कम करने के लिए, एक केंद्रापसारक गति बढ़ा सकता है । हमारे मामले में, एक उच्च गति का उपयोग (२१,००० x g) बफर बी के दौरान हमारे नमूनों गोली करने के लिए काफी कम सेल नुकसान बहाकर । हालांकि, कोशिकाओं zymolyase पाचन के बाद बहुत नाजुक हो, तो केंद्रापसारक गति बदलने की सिफारिश नहीं है । इसके बजाय, हम संयुक्त राज्य अमेरिका वैज्ञानिक, जो बहुत formamide धोने बफर में बहाकर दौरान कोशिकाओं गोली मदद से कम आसंजन ट्यूब का उपयोग सुझाव देते हैं । कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल लगातार कुशल इमेजिंग के लिए पर्याप्त घने कोशिकाओं के एक monolayer उत्पंन कर सकते हैं । आमतौर पर, देखने के 7 क्षेत्रों > 130 ठहराव के लिए उपयुक्त कोशिकाओं उपज चाहिए ।
अंत में, यह करने के लिए इष्टतम मापदंडों और छवि विश्लेषण से आवश्यक outputs निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है । smFISH धब्बे का पता लगाने के लिए, प्रकाशित विश्लेषण कार्यक्रम आमतौर पर कच्चे छवियों गाऊसी कर्नेल का उपयोग करने के लिए पृष्ठभूमि संकेत को दूर फ़िल्टर, और उपयोगकर्ताओं को संकेत करने वाली शोर अनुपात का निर्धारण करने के लिए छवियों के प्रत्येक सेट के लिए उपयोग करने के लिए2,17। दुर्भाग्य से, वहाँ वर्तमान में एक मानक है जिसके द्वारा उचित मापदंडों निर्धारित कर रहे हैं नहीं है, और इसलिए इन विभिन्न सेटिंग्स के कुछ अनुभवजंय परीक्षण आवश्यक है. इन चरणों में से प्रत्येक के लिए आवश्यक पैरामीटर्स को सेट करने के लिए, एक इनपुट विभिन्न सेट को पैरामीटर्स की iteratively करने की आवश्यकता है और जांचें कि प्रत्येक सेट से प्राप्त परिणाम कितनी अच्छी तरह हैं, जो कुछ प्रतिनिधि कक्षों में मैन्युअल रूप से गणना करने से मिलता है. एक बार मापदंडों का एक सेट पाया जाता है, यह विभिन्न विकास की स्थिति और आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बावजूद प्राप्त छवियों के अधिकांश के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इसके अलावा, एक अगर smFISH छवियों की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण ठहराव से पहले किया जा सकता है परीक्षण कर सकते है22। इस चरण स्थान का पता लगाने एल्गोरिथ्म को सरल और काफी इमेजिंग समय कम कर देता है, हालांकि व्यक्तिगत स्पॉट, जैसे उनके सेलुलर स्थानीयकरण के बारे में कुछ संभावित उपयोगी जानकारी की कीमत पर । हमारे मामले में, mRNA NDC80 जीन द्वारा उत्पादित अणुओं की संख्या काफी कम है कि धब्बे अच्छी तरह से इस प्रक्रिया के बाद अलग किया गया था (के लिए असामांय नहीं नवोदित खमीर3में टेप के लिए,7) । मामलों में जहां colocalization विश्लेषण महत्वपूर्ण है, विश्लेषण पाइपलाइन colocalization का आकलन करने के लिए प्रत्येक चैनल में प्रत्येक smFISH स्पॉट का स्थान निर्धारित करने के लिए की जरूरत है । पूछे जाने वाले विशिष्ट प्रश्नों पर निर्भर करते हुए, प्रत्येक स्थान की गहनता जैसी अन्य जानकारी भी आगे विश्लेषण के लिए पाइप लाइन से निकाले जाने की आवश्यकता हो सकती है. प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम और छवि विश्लेषण पाइपलाइन अनुकूलन smFISH डेटा के उच्च गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए ब्याज के सवाल का अध्ययन करने में महत्वपूर्ण है ।
The authors have nothing to disclose.
हम कैसे smFISH प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए पर सलाह के लिए ऐनी Dodson और स्टेफ़नी हेनरिक धंयवाद, जेवियर Darzacq विश्लेषण मंच, सांख्यिकीय विश्लेषण पर सुझावों के लिए हैयान हुआंग के साथ मदद के लिए । यह काम पैसा (5-FY15-99), बेंच चैरिटेबल ट्रस्ट (०००२७३४४), Damon Runyon कैंसर रिसर्च फाउंडेशन (35-15) और ग्लेन फाउंडेशन EÜ को मार्च से धन द्वारा समर्थित किया गया था, और एक NSF स्नातक अनुसंधान फैलोशिप अनुदान नहीं । डीजीई-११०६४०० को जे. के.
BSA, RNase-free (50 mg/mL) | Ambion | AM2616 | Store at -20 °C. |
Catalase | Sigma | C3515 | Store at 4 °C for short-term. Vortex before use. |
DAPI | Sigma | D9564 | Store at -20 °C after reconstitution in water. Protect from light. |
50% Dextran Sulfate | Milli Pore | S4030 | Store at room temperature. Very viscous liquid. Handle with patience. |
E. coli tRNA | Sigma | R4251 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Ethanol (100%, 200 proof) | various | Flammable. | |
37% Formaldehyde | Fisher | F79-500 | Store at room temperature. Toxic. Use and dispose with caution. |
Formamide | Ambion | AM9342 | Store at 4 °C. Open after the temperature equilibrates to room temperature in order to prevent oxidation. Toxic. Use and dispose with caution. |
Glucose | various | Store at 4 °C after dissolving in nuclease-free water. | |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in 50 mM NaOAc, pH 5. |
Nuclease-free water | Ambion | AM9932 | Store at room temperature. |
Potassium phosphate (monobasic and dibasic) | various | Store at room temperature. | |
Probe library, diluted in TE, pH 8.0 | Biosearch Technologies | Store at -20 °C in aliquots (5 µL) after reconstitution in TE pH 8.0, following the instructions from the manufacturer. Protect from light. | |
Sorbitol | various | Store at room temperature. | |
20X SSC | Ambion | AM9763 | Store at room temperature. |
TE, pH 8.0 | Ambion | AM9849 | Store at room temperature. |
1 M Tris, pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Store at room temperature. |
Trolox | Sigma | 238813 | Store at -20 °C in aliquots. |
200 mM Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | NEB | S1402S | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution, following the instructions from the manufacturer. |
Zymolyase 100T | MP Biomedicals | 08320932 | Store at -20 °C in aliquots after reconstitution in water. |
Low-adhesion tubes | USA Scientific | 1415-2600 | Store at room temperature. |