Her presenterer vi en cellebasert flyt cytometri metode for å oppdage nøytraliserende antistoffer eller andre faktorer som påvirker mobilnettet opptaket av enzymet erstatning terapi i en menneskelige matrise som hjerne spinalvæske (CSF) eller humant serum.
Administrasjon av enzymet erstatning terapi (ERTs) og andre biologiske terapier pasienter kan lokke fram en anti-narkotika immunrespons. Karakterisering av disse anti-narkotika-antistoffer (ADA), spesielt de som kan nøytralisere den biologiske aktiviteten av stoffet, kalt nøytraliserende antistoffer (NAbs), er avgjørende å forstå effekten av disse antistoffene på stoffets farmakologiske profil. Denne protokollen beskriver en cellebasert flyt cytometri metode for å finne faktorer som nøytraliserer mobilnettet opptaket av en representant lysosomale ERT i menneskelige matrise. Protokollen består av tre fremgangsmåter: screening og et bekreftende skritt titer analyser å merker, identifisere og etablere de relative nivået av nøytralisere antistoff titer i emnet eksempler.
I denne metoden prøver er først blandet med fluorophore-konjugerte ERT produktet, så inkubert med celler [f.eksmenneskelige T-lymfocytter (Jurkat celler)] som uttrykker en celle-overflate kasjon uavhengig mannose 6-fosfat reseptor (CI-M6PR), og til slutt, analysert med en flyt cytometer. Et utvalg uten NAbs vil resultere i opptaket av den fluorophore-konjugerte ERT produktet via CI-M6PR, mens, tilstedeværelse av NAbs vil binde til stoffet og forstyrre CI-M6PR bindingen og opptak. Hvor mye fluorophore-konjugerte ERT internalisert Jurkat cellene er målt ved flowcytometri og evaluert som prosent (%) signal hemming sammenlignet med svaret innhentet i nærvær av en representant stoffnaive matrise. I bekreftende trinn er prøvene pre inkubert med ERT-konjugerte magnetiske perler å utarme stoff-spesifikke faktorer som binder til stoffet (som NAbs) før en inkubasjon med celler. Prøver som skjermen og bekrefte positive for stoff-spesifikke NAbs i analysen er deretter serielt utvannet for å generere et antistoff titer. Semi kvantitative antistoff titers kan være korrelert med mål av narkotika sikkerhet og effekt.
Immunogenisitet vurdering er en viktig del av sikkerhet og effekt Overvåkingsprogram for biologiske terapeutiske produkter, inkludert ERTs. Pasienter kan utvikle en immunrespons som kan direkte påvirke narkotika sikkerhet og effekt farmakokinetiske/Farmakodynamiske profiler. Et delsett av disse ADA, kalt NAbs, kan hemme ERT effekt på to måter: gjennom hemming av ERT opptaket i målrettede cellen eller begrenser ERT katalytisk aktiviteten. Metoden som presenteres her er utviklet for å måle NAbs som forstyrrer ERT opptaket i celler. For å fullt overvåke effekten av den terapeutiske ERT, er kontinuerlig overvåking av NAbs avgjørende i Klargjørende alle mulige sammenhenger med kliniske utfall eller Farmakodynamiske effekter1.
Plattformer for å vurdere NAbs mot protein therapeutics inkluderer cellen-basert, enzymatisk aktivitet og ligand-bindende analyser1. Optimal analysen plattformen er valgt basert på en rekke kriterier: virkningsmekanismen av terapeutiske produktet, analysen plattform følsomhet, selektivitet, presisjon, og viktigst, dens evne til å etterligne hemmende effekten av NAbs i vivo . Ligand-bindende analyser kan være riktig i enkelte tilfeller (f.eksnår en aktuelle cellen linje ikke kan identifiseres eller hvis riktig følsomheten ikke kan oppnås i en cellebasert analysen). Men i 2016 utkastet FDA veiledning for bransje dokumentet og andre industri-akseptert utredninger, cellebasert NAb analyser er anbefalt fordi de kan bedre reflektere biologiske mekanismen av stoffet i vivo1,2 , 3.
De kritiske komponentene for å utvikle en flyt cytometri cellebasert NAb analysen omfatter en egnet cellen linje som svarer til stoffet stimulering, en surrogat positive-kontroll NAb som nøytraliserer ERT, en fluorophore-konjugerte ERT og test arten biologiske Matrix4,5,6. Linje celleutvalget er avhengig av ERT virkningsmekanismen og flere linjer skal vurderes under analysen utvikling3. I metoden beskrevet her, ble menneskelige Jurkat T celler valgt for deres endogene CI-M6PR uttrykk på celleoverflaten og mangel på antistoff fragment reseptorer (anleggene) som binder ukritisk regionen Fc i de fleste antistoffer7,8 . Under analysen utvikling er det viktig å etablere en negativ kontroll for validering studiene og pasienten prøven testing, som serum samlet fra personer som ikke har blitt behandlet med test artikkel1. Cellelinjer bør også tolerere relevante matriser fra ulike arter for kontinuitet over de nonclinical, kliniske og post markedsføring stadiene av narkotika utvikling1. En annen komponent er utvalget av analysens positiv kontroll. Kontrollen positiv for ERT celle opptaksanalyse ble valgt basert på dens evne til å binde terapeutisk og nøytralisere opptaket gjennom CI-M6PR9,1. Det er ofte vanskelig å få nyttig eller bærekraftig mengder nøytraliserende antisera fra menneskelig fag som en analysen kontroll, spesielt i sjeldne sykdommen pasientgrupper2. Alternativer inkluderer antisera fra hyper-vaksineres dyr eller affinitet-renset polyklonale eller monoklonale antistoffer piggete inn i analysen relevante matrise1. Mens du bruker en artsspesifikke matrise, er det mulig at hemmende faktorer enn antistoffer i matrisen kan hemme ERT opptaket. En annen komponent til analysen er fluorophore-konjugerte ERT. Valg av fluorophore for ERT Bøyning bør vurderes for hver ERT, basert på analysens behov for lysstyrke, pH stabilitet og potensielle spectral overlapping i andre kanaler på flyt-cytometer.
Analysen beskrevet her er et eksempel for å måle en NAb til en terapeutisk protein, for eksempel en ERT, som angir den celle via CI-M6PR. Flere ERTs, ment å behandle lysosomale lagring lidelser (LSDs), bruke denne veien for cellen opptak og lysosomale målretting, inkludert elosulfase alfa for Morquio A syndrom, cerliponase alfa for CLN2 Batten syndrom, agalsidase alfa for Fabrys sykdom, og alglucosidase alfa for Pompe sykdom10,11. Formålet med denne metoden er å måle den relative nivået av NAbs som forstyrrer narkotika bindende og internalisering via CI-M6PR. Dette utføres i lagdelt screening, bekreftende, og titer trinn3. Eksempler er først vist for NAb positivitet og deretter bekreftet positive i bekreftende trinn. Endelig, prøver som skjermen og bekrefte positive kan serielt fortynnes for å generere en antistoff titer1. Denne cellen-basert flyt cytometri narkotika opptaksanalyse gir en følsom og mechanistically relevante i vitro metoden av måler rusmiddelspesifikke NAbs som kan påvirke stoffets farmakologiske profil. Vi har tidligere godkjent metoden og testet klinisk prøver ved denne plattformen for narkotika elosulfase alfa8. Her beskriver vi detaljerte trinnvise protokollen som kan brukes på andre terapeutiske proteiner eller ERTs.
Nøytraliserende antistoffer eller andre faktorer som hindrer ERT opptaket gjennom CI-M6PR har potensial til å påvirke ERT sikkerheten eller effekten1. Derfor er det viktig å vurdere NAbs i emnet prøver med en robust modell relevant for stoffets virkningsmekanismen. Vi har funnet at ytelsen til enkelte bioassay formater (f.eks, reseptoren dimerization, luciferase uttrykk, etc.) ikke align med helse myndighet anbefalinger for analysen presisjon, reproduserbarhet og følsomhet 29. i bioassay metoden beskrevet her Jurkat celler som uttrykker endogene CI-M6PR er ansatt overvåke NAbs gjelder for lysosomale ERT opptaket. Kombinert med en flyt cytometri avlesning, bruker denne analysen fysiologiske celle modell med passende analysen presisjon, følsomhet, reproduserbarhet og høy utvalg ytelse. NAb oppdagelsen med en flyt cytometri avlesning har også blitt brukt til andre indikasjoner. For eksempel har metoder blitt utviklet for å oppdage eksisterende antistoffer mot hepatitt E og adeno-assosiert virus (AAV)30,31.
Avgjørende skritt i protokollen inkludere velge en egnet fluorophore, omfatter en LQC at skjermer analysen følsomhet, sikre et tilstrekkelig nivå av cellen levedyktighet, og opprettholde streng overholdelse av inkubasjon tider. I eksemplet presenteres her fluorophores (f.eks, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 og CypHer 5e), konjugert til en lysosomale ERT, store variasjoner i resultatene. Alexa Fluor 647, som også var den smarteste fluorophore testet32, ble valgt for analysen videreutvikling. Det anbefales at flere fluorophores vurderes tidlig i utviklingen av analysen å gi den beste sensitivitet og dynamisk område. Analysen følsomhet under eksempelannonsene testing bør overvåkes ved å inkludere en LQC som er nært nok følsomhet grensen vil mislykkes i 1% av testing starter1. Sammen med HQC fungerer LQC også som et system egnet QC overvåke analysen drift over tid3. Optimal celle levedyktighet og ytelse oppnås ved forbereder en cellen bank av engangs dele og kvalifisering i ny cellen banker basert på sammenlignbare QC resultater3,18. Celle- og fluorophore-konjugerte drug-inkubering ganger er også sentralt i en konsekvent analysen ytelse siden narkotika opptak øker med tiden stoffet er ruges med celler. For å minimere daglige variasjon i stoffet opptak, kan eksempeldata normaliseres gruppert matrix kontroll smakebiter på hver plate (f.eks, kutt punkt kontroll eksemplene i metoden over). En annen viktig faktor i å produsere konsekvente data med denne metoden er å overvåke plate ensartethet og minimere mulige kanten. En innledende forsøket kan inkludere utfører analysen bruker en enkelt QC over hele platen, mens mer robust eksperimenter kan utføres under analysen validering (f.eks, presisjon og nøyaktighet)1. Dette demonstrerer viktigheten av platen kart oppsett33. Som vist i eksemplet plate kart, plassert kvalitetskontroll prøver på begge sider av platen skjermen en ensartethet som kan spores over tid med Levey-Jennings diagrammer34.
Mens denne analysen overvåker NAbs og andre faktorer som kan hemme lysosomale ERT opptak, kan flere eksperimenter utføres for å bekrefte en opptak hemming på grunn av antistoffer. Ett alternativ er å behandle prøver med protein A/G/L, som nonspecifically binder immunglobulin35. Hvis prøver fortsatt testen positiv etter protein A/finans utarming, kan en ikke-antistoff hemmende faktor være ansvarlig for sperring narkotika opptaket. Metoden beskrevet her ble utviklet for å måle antistoff-mediert opptak hemming, og positiv kontrollen og andre analysen parametere bør vurderes hvis en høy andel av emnet prøver med ikke-antistoff hemmende faktorer.
Analysen kan også være ytterligere preget for å demonstrere fluorophore-merket narkotika traffics riktig mobilnettet rommet basert på stoffets virkningsmekanismen. I eksemplet presenteres her forventes en ERT å binde CI-M6PR på cellens overflate og trafikk det til lysosome. Vi tidligere rapportert resultatene av flere eksperimenter som angir at nesten alle fluorescerende signalet observert i metoden resultatene fra fluorophore-merket ERT i lysosome8. Vi fant at fluorophore-merket ERT signalet ble eliminert etter behandling av celler med cytochalasin B, som forstyrrer internalisering gjennom hemming av utgangen omorganisering. Eksperimenter som slukket eksterne fluorophore med trypan blå eller redusert internalisering ved å plassere celler ved 4 ° C, angi også at ERT fluorophore-merket er raskt internalisert og lite fluorescens skyldes en ERT bundet på celleoverflaten. Lysosomale målretting ble bekreftet ved å visualisere den co lokaliseringen av pH-sensitive lysotracker farge med fluorophore-konjugerte stoffet med AC confocal mikroskopi. En spesifisitet for opptak gjennom CI-M6PR kan også verifiseres ved hjelp av eksogene M6P for å konkurrere med merket narkotika for reseptor bindende. Lignende eksperimenter skal utføres for å kontrollere opptak kinetics og mobilnettet lokalisering av fluorophore-konjugerte narkotika i andre analyser.
Denne cellen-basert analysen plattformen er brukt til å studere NAbs for terapeutisk stoffer som bruker CI-M6PR reseptor-mediert endocytose. Vi har nylig rapportert resultater denne analysen plattformen som viste ingen sammenheng mellom utviklingen av en NAb og narkotika effekt for elosulfase alfa36,37. For å validere analysen for klinisk prøve testing, parameterne, inkludert analysen følsomhet, presisjon, selektivitet, spesifisitet, narkotika toleranse, robusthet, og kutte poeng, bør vurderes i henhold til etablerte guidances3, 4. det også bemerkes for lysosomale ERTs, at NAbs kan utvikle til å forstyrre narkotika aktivitet gjennom bindende nær katalytisk enzym. Generelt vurdere vi overvåking denne typen NAb å ha lavere prioritet, fordi det harde syreholdig og proteolytisk miljøet i lysosome ikke er gunstig antistoff-ERT interaksjoner2,39,40. Det er imidlertid mulig at proteolytisk-resistente NAbs finnes og kan hemme den katalytiske delen av en narkotika-40. Denne analysen skjermer fluorophore-merket ERT opptak i lysosome, og en begrensning av analysen er manglende evne til å overvåke proteolytisk-resistente NAbs. Hvis denne typen NAb mistenkes basert på sikkerheten eller effekten data, bør en analyse som overvåker ERT bruk utviklet og brukes til å teste prøver.
Vurdering av immunogenisitet er viktig å forstå effekten av NAbs på stoffet sikkerhet og effekt. Identifikasjon av NAbs i stand til å hemme i vitro narkotika opptak via CI-M6PR gir en mulighet for å forstå NAb aktivitet i vivo. Metoden som presenteres her bruker en human celle linje som uttrykker CI-M6PR for å måle forstyrrelser av fluorophore-konjugerte lysosomale ERT mobilnettet opptak. Denne metoden er allerede brukt til å overvåke NAbs for flere ERTs skal behandle lysosomale lagring sykdommer. Denne analysen plattformen kan gjelde for andre metoder for å studere virkningene av NAbs på biologiske legemiddelselskap som krever en mobilnettet internalisering for sin rette funksjon.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne har ingen takk.
0.22 µm filter unit, 500 mL vacuum filter flasks | Corning | CLS430769 | |
Round Bottom 96-well culture plates | Thermo-Nunclon | 163320 | |
Sterile reagent reservoirs | VistaLab | 3054-1004 | |
96 well white round bottom polystyrene microplate plate | Corning | 3605 | |
96-well Polypropylene Tubes, 8-Tube Strips | Corning | 4408 | |
Magnetic bead separator tube rack | V&P Scientific, Inc | VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3 | |
DynaMag -2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
DynaMag -96 Side Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | |
BD FACSCanto II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
BD High Throughput Sampler (HTS) | BD Biosciences | ||
BioRad TC20 Automated Cell Counter | BioRad | 1450103 | |
Microplate Shaker | VWR | 12620-928 | |
Galaxy MiniStar Microcentrifuge | VWR | C1413 | |
tissue culture CO2 incubator | Nuaire | NU-4750 | |
Biosafety cabinet | Labcono | Purifier Cell Logic + | |
Jurkat Cell Line | ATCC | TIB152™ | |
Alexa Fluor 647 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | A20173 | |
Dynabeads M270 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 65306 | |
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
RPMI-1640 1X Medium | Life Technologies | A10491-01-500mL | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ATCC | 30-2020 | |
Pen-Strep (100X) liquid formulation | Corning | 30-002-CI | |
1X DPBS without calcium and magnesium | Corning | 21-031-CV | |
4% Para-formaldehyde | Electron Microscopy Science | 15735-85 | |
LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Life Technologies | L34955 | |
Tween 20 | Sigma | P1379-100mL | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | 3059 | |
Pooled human matrix (e.g. human serum or cerebrospinal fluid) | Bioreclamation IVT | request a quote from website | |
VWR Polyester Plate Film | VWR | 60941 | |
Seal & Sample Aluminum Foil | Beckman Coulter | 538619 |