एंटीबॉडी arrays द्वारा संकेत Transduction रास्ते की एक पूछताछ के द्वारा Tyrosine कळेनासे अवरोधकों के लिए प्रतिरोध का आकलन
Summary
यहाँ, हम विभिन्न सेलुलर मॉडल में संकेत रास्ते में परिवर्तन की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी arrays के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इन परिवर्तनों को, दवाओं/हाइपोक्सिया/अल्ट्रा वायलेट प्रकाश/विकिरण, या द्वारा व्यक्त की वजह से downregulation/नॉकआउट, विभिंन रोग मॉडल के लिए महत्वपूर्ण है और संकेत कर सकते है कि एक चिकित्सा प्रभावी हो जाएगा या दवाओं के तंत्र की पहचान कर सकते है प्रतिरोध.
Abstract
प्रोटीन फास्फारिलीकरण नेटवर्क के एक ंयायपालिका विनियमन के साथ कैंसर रोगियों अक्सर tyrosine कळेनासे अवरोधकों के साथ इलाज कर रहे हैं । प्रतिक्रिया ८५% की दर आ आम हैं । दुर्भाग्य से, रोगियों को अक्सर उनके संकेत transduction रास्ते बदलकर उपचार के लिए दुर्दम्य हो जाते हैं । microarrays के साथ अभिव्यक्ति की रूपरेखा का एक कार्यांवयन समग्र mRNA स्तर के परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं, और प्रोटियोमिक् प्रोटीन के स्तर में समग्र परिवर्तन की पहचान कर सकते है या शामिल प्रोटीन की पहचान कर सकते हैं, लेकिन संकेत की गतिविधि transduction रास्ते केवल प्रोटीन के बाद अनुवाद संशोधन पूछताछ द्वारा स्थापित किया जा सकता है । एक परिणाम के रूप में, की पहचान करने की क्षमता है कि क्या एक दवा उपचार सफल है या कि प्रतिरोध उठी, या संकेत रास्ते में किसी भी परिवर्तन की विशेषता की क्षमता, एक महत्वपूर्ण नैदानिक चुनौती है । यहां, हम एक उपकरण है जो विभिंन पद-शोधों संशोधनों में प्रणाली व्यापक परिवर्तन की पहचान कर सकते है (जैसे, फास्फारिलीकरण) के रूप में एंटीबॉडी arrays की एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं । एंटीबॉडी arrays का उपयोग कर के लाभों में से एक उनकी पहुंच भी शामिल है (एक सरणी या तो प्रोटियोमिक् या महंगा उपकरण में एक विशेषज्ञ की आवश्यकता नहीं है) और गति । पोस्ट-शोधों के संशोधनों के संयोजन को लक्षित करने वाली सरणियों की उपलब्धता प्राथमिक सीमा है । इसके अलावा, निष्पक्ष दृष्टिकोण (phosphoproteomics) उपंयास खोज के लिए और अधिक उपयुक्त हो सकता है, जबकि एंटीबॉडी arrays सबसे व्यापक रूप से विशेषता लक्ष्य के लिए आदर्श होते हैं ।
Introduction
लक्षित tyrosine कळेनासे अवरोधकों (TKI) के नैदानिक कार्यांवयन प्रभावी उपकरण के साथ चिकित्सकों प्रदान करने के लिए विशिष्ट प्रोटीन है कि नवोत्पादित परिवर्तन ड्राइव लक्ष्य द्वारा कैंसर के उपचार बदल गया है । इन यौगिकों को रोकती है या tyrosine kinases1,2द्वारा लक्षित प्रोटीन के फास्फारिलीकरण ब्लॉक । TKIs भाग में विकसित किया गया क्योंकि विभिंन प्रमुख संकेत जीन में आनुवंशिक परिवर्तन के लिए कैंसर दीक्षा और प्रगति ड्राइव पर्याप्त है [जैसे, एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR), आद्य-oncogene tyrosine-प्रोटीन कळेनासे src (src), BCR-ABL, और मानव एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2)]3,4. सेल चक्र पर TKIs का प्रभाव5 और आणविक संकेतन रास्ते6 आणविक निर्देशित कैंसर के इलाज के लिए लक्ष्य से एक परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है । कीमोथेरेपी बनाम TKIs का महत्वपूर्ण लाभ वृद्धि की प्रतिक्रिया दर और स्वस्थ कोशिकाओं को विषाक्तता के कम जोखिम है7. नतीजतन, उपंयास TKIs के अनुसंधान और विकास पर ध्यान बढ़ रहा है ।
जीनोमिक अनुक्रमण परिणामों के लिए उपयोग मानव जीनोम परियोजना8,9,10 के साथ शुरू किया और विभिन्न अगली पीढ़ी (NextGen) कैंसर sequencing प्रयासों के साथ आज जारी है [जैसे, कैंसर जीनोम एटलस (TCGA)११,१२]. यह कई प्रयोगात्मक तरीके कि जीन के हजारों पर एक साथ जानकारी प्रदान करने के लिए प्रेरित किया है और/या जीन या जैविक perturbations13द्वारा संग्राहक प्रोटीन की निष्पक्ष स्नैपशॉट प्रदान करते हैं । सेलुलर समारोह के विनियमन के बाद से कई स्तरों पर होता है, जीन की प्रतिलेखनी से प्रोटीन और उनकी गतिविधि, सेलुलर समारोह को नियंत्रित करने की घटनाओं की एक पूरी समझ के बाद अनुवाद करने के लिए होगा अंततः विभिंन जैविक readouts से डेटा के एकीकरण की आवश्यकता है । एक एकल सेल जीन संकल्प के साथ हजारों जीन के दूत आरएनए (mRNA) स्तर पर नजर रखने की क्षमता एक पूरे जीनोम पैमाने पर जीन समारोह और बातचीत के बारे में अनुमान बनाने की क्षमता बढ़ गई है । हालांकि, जीन अभिव्यक्ति arrays की व्याख्या हमेशा स्वाभाविक विनियमन के अंय स्तरों के एकीकरण के बिना अधूरा होगा: अर्थात्, प्रोटीन अभिव्यक्ति का स्तर, प्रोटीन संशोधन राज्यों, और प्रोटीन के बाद अनुवाद संशोधन (फास्फारिलीकरण, ubiquitylation, मिथाइल, आदि) । यहां, हम एंटीबॉडी arrays की उपयोगिता का वर्णन के रूप में एक ही प्रयोग14,15में विभिंन स्थितियों के एक समारोह के रूप में महत्वपूर्ण संकेतन घटकों के पोस्ट अनुवाद संशोधन पूछताछ का मतलब है, 16.
Phospho-एंटीबॉडी arrays को भेद और संकेत transduction रास्ते16में परिवर्तन का विश्लेषण नियोजित किया जा सकता है । ये एक आनुवंशिक संशोधन या कळेनासे अवरोधकों, chemotherapeutics, ग्लूकोज अभाव, हाइपोक्सिया, या सीरम भुखमरी की वजह से तनाव के साथ सेल लाइनों के उपचार से पैदा कर सकते हैं । के नोट, दवा प्रतिरोध या एक विशिष्ट जीन अप-या downregulation भी संकेत transduction रास्ते में परिवर्तन के कारण कर सकते हैं17.
दवा प्रतिरोध, उदाहरण के लिए, संवेदनशीलता से बचने के लिए दवा लक्ष्य के उत्परिवर्तनों से पैदा कर सकते हैं । फेफड़ों के कैंसर में जाना जाता EGFR उत्परिवर्तनों कुछ TKIs के लिए अतिसंवेदनशील कैंसर प्रदान करते हैं, लेकिन अधिक दूसरों के लिए अतिसंवेदनशील । वैकल्पिक संकेत रास्ते17उत्परिवर्तन पर सक्रिय किया जा सकता है । संकेत transduction प्रतिरोध और हाइपोक्सिया, आदिमें शामिल रास्ते की पहचान के लिए एक व्यापक आवेदन के रूप में, phospho-एंटीबॉडी arrays में और अधिक जानकारी प्रदान करते हैं, और फलस्वरूप की समझ, शामिल तंत्र ।
प्रौद्योगिकियों कि प्रोटीन संशोधनों के एक आकलन की अनुमति प्रणालियों के एक महत्वपूर्ण घटक का प्रतिनिधित्व करते है क्योंकि वे अक्सर एक नियामक समारोह की सेवा, इस तरह के एक एंजाइम या प्रोटीन के बीच शारीरिक बातचीत की गतिविधि संग्राहक के रूप में । पोस्ट-शोधों के संशोधनों का महत्व लगभग सभी extracellular-ट्रिगर्ड सिग्नल transduction18में प्रोटीन फास्फारिलीकरण की भूमिका से सचित्र है । परंपरागत रूप से, kinases या प्रोटीन की फास्फारिलीकरण स्थिति की पहचान भी पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, खासकर अगर शोधकर्ता केवल 1 में रुचि है-5 लक्ष्य । हालांकि, पश्चिमी दाग बहुत चयनात्मक है और पूर्व ज्ञान की ओर पक्षपातपूर्ण किया जा सकता है और एक परिणाम के रूप में महत्वपूर्ण लक्ष्य याद हो सकता है । एंटीबॉडी सरणी (ओं) एक ठोस मैट्रिक्स (जैसे, कांच या ubiquitin) पर विभिंन कब्जा एंटीबॉडी [पैन विशिष्ट phosphorylated tyrosine (एस), विरोधी nitrocellulose, आदि] embedding द्वारा एकाधिक लक्ष्यों का एक मध्यम प्रवाह readout प्रदान करते हैं । माध्यमिक एंटीबॉडी एक सैंडविच आधारित एलिसा प्रारूप में विशिष्ट प्रोटीन के बारे में जानकारी प्रदान (चित्रा 1) । इस परख और अधिक शक्तिशाली और प्रासंगिक हो जाता है के रूप में अधिक लक्ष्य हित के है या पूर्व ज्ञान15प्रतिबंधित है । phospho-arrays और अधिक मोटे तौर पर काम कर रहे है के रूप में वे फास्फारिलीकरण तुलना के रूप में अच्छी तरह से एक प्रयोग में लक्ष्य की एक व्यापक विविधता के प्रोटीन की सामांय मात्रा में कर सकते है और एक महत्वपूर्ण जन स्पेक्ट्रोमेट्री पर सुधार ठहराव प्रदान करते हैं । यह तकनीक नई या पहले से अज्ञात फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान के लिए लागू नहीं है ।
बड़े पैमाने पर जन स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रोटियोमिक् प्रोटीन की विशिष्ट फास्फारिलीकरण साइटों की पहचान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है19. हालांकि इस तकनीक के बाद अनुवाद की घटनाओं के हजारों गणना कर सकते हैं, यह महंगा उपकरण, समर्पित प्रयोगात्मक पाइपलाइनों की आवश्यकता है, और एक गणना विशेषज्ञता है कि सबसे शोधकर्ताओं की पहुंच से परे हैं ।
एंटीबॉडी arrays16readouts विभिंन प्रोटीन पर एक साथ readout प्रदान करते हैं । ये प्रोटीन ubiquitylation (ubiquitin ऐरे) या फास्फारिलीकरण में परिवर्तन हो सकता है. इस सरणी प्रौद्योगिकी का मुख्य लाभ यह है कि यह महत्वपूर्ण सेल मापदंडों के साथ जुड़े विभिन्न जैविक रास्ते की जैविक स्थिति पर महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया प्रदान करता है (५३ केडीए के प्रोटीन, p53, रिसेप्टर tyrosine kinases, और intracellular रास्ते) साथ. इसके अलावा, यह एक परख (जैसे, apoptosis और ubiquitin और फास्फारिलीकरण) के प्रवेश को बढ़ाने के लिए विभिंन सरणी प्रकार गठबंधन करने के लिए संभव है । इस क्षमता एकाधिक arrays कई नमूनों में एक साथ एक समय में विभिंन पद-अनुवाद परिवर्तन का आकलन करने के लिए गठबंधन और लागत प्रभावी तरीके से है कि विशिष्ट उपकरण या विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है मामले में एक महत्वपूर्ण लाभ की है एंटीबॉडी arrays की ।
Protocol
Representative Results
Discussion
दृष्टिकोण है कि कई जैविक readouts गठबंधन एक प्रयोग में सेलुलर मशीनरी के स्वाभाविक अधिक सटीक प्रतिनिधित्व कर रहे है प्रदर्शन किया । phospho के आगमन-एंटीबॉडी arrays संशोधनों के पैटर्न जो किसी भी एक प्रोटीन के संशोधन ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम लॉरेंस जे एलिसन संस्थान की परिवर्तनकारी चिकित्सा के उदार वित्तीय सहायता के लिए आभारी है यूएससी (डेविड Agus के लिए एक उपहार) । हम शरद ऋतु Beemer और लिसा Flashner जो पीढ़ी और इस पांडुलिपि के प्रकाशन के लिए नेतृत्व के समर्थन की सराहना करते हैं । हम उसे प्रशासनिक समर्थन के लिए लौरा एनजी धंयवाद ।
Materials
| Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363212 | |
| Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
| Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
| Tissue Culture dish 100mm | TRP | 93100 | |
| ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27G5/8, 1ml for needle treatment of protein samples |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
| Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
| Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
| Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
| SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
| IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
| LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
| TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher | 78446 | |
| RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
| Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
| ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
| SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |
References
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