ここでは、様々 な細胞モデルにおけるシグナル伝達経路の変化を識別するために抗体のアレイのためのプロトコルを提案する.薬/低酸素/超紫外光・放射、または過剰発現/ダウンレギュレーション/ノックアウトによって発生、これらの変更は様々 な疾患モデルの重要であり、治療が有効になりますまたは薬のメカニズムを特定することができるかどうかを示すことができます。抵抗。
タンパク質リン酸化ネットワークの異常調節がん患者はしばしば、チロシンキナーゼ阻害剤と扱われます。反応率が 85% に近づいているが一般的です。残念ながら、患者頻繁なる治療に不応性のシグナル伝達経路を変えることによって。マイクロ アレイによる発現プロファイルの実装は、全体的な mRNA レベルの変更を識別できるとプロテオミクス蛋白質のレベルの全体的な変化を識別することができます。 または、タンパク質ですが、シグナル伝達の活動を識別することができます。経路は、タンパク質の翻訳後修飾を尋問することによってのみ設定できます。その結果、シグナル伝達経路の任意の変化を特徴付ける能力、または薬物治療が成功したかどうか、または抵抗が生じたかどうかを識別する能力は、重要な臨床的課題です。ここでは、様々 な翻訳後修飾 (例えば、リン酸化) でシステム全体にわたる変更を特定するツールとしての抗体のアレイの詳細な説明を提供します。抗体のアレイを使用する利点の 1 つは、そのアクセシビリティ (配列は、プロテオミクスの専門家か、高価な装置は必要ありません) と速度が含まれています。翻訳後修飾の組み合わせをターゲット配列の可用性は、主な制限です。さらに、抗体のアレイは、最も広く特徴付けられたターゲットに最適に対し公平なアプローチ (プロテオミクス) が新規発見に適してあります。
対象となるチロシンのキナーゼ阻害薬 (TKI) の臨床の実装は、そのドライブ メタアナライシス医師を特定のタンパク質を対象とする効果的なツールを提供することでがん治療を変えてきました。これらの化合物を阻害またはチロシンのキナーゼ1,2の対象となるタンパク質のリン酸化をブロックします。こは一部開発された様々 な重要な遺伝子をシグナル伝達における遺伝的変化が十分にドライブ癌の開始そして進行 [例えば、上皮成長因子受容体 (EGFR) においてチロシン蛋白質キナーゼ Src (SRC) のでBCR-ABL とひと上皮成長因子受容体 2 (HER2)]3,4。分子シグナリング経路6細胞周期5この影響から、不特定多数に向けた誘導分子がん治療への変換を表します。ず対化学療法の主な利点は高められた奏効率と健康な細胞7への毒性のリスクが低い。その結果が増えているこの小説総合研究に着目。
ゲノム シーケンスの結果へのアクセスは人間ゲノム プロジェクト8,9,10で開始し、様々 な次世代 (ネクストジェン) がん努力を配列 [例えば、がん遺伝子と今日続けてアトラス (TCGA)11,12]。これは、たくさんの遺伝子の同時情報および/またはの遺伝子または蛋白質の生物学的摂動13によって変調された公平なスナップショットを提供する多くの実験的方法論を触発しています。細胞機能の調節は、タンパク質とその活性の翻訳後修飾遺伝子の転写から、複数のレベルで行われるために、細胞機能を制御するイベントの完全な理解が最終的には様々 な生物学的読み出しからのデータの統合が必要です。たくさんの遺伝子単一セルの解像度を持つ遺伝子のメッセンジャー RNA (mRNA) レベルを監視する機能は、全ゲノム規模で遺伝子の機能や相互作用について推論する能力を増加しています。ただし、遺伝子発現アレイの解釈常に不完全になります本質的に規制の他のレベルの統合なし: すなわち、タンパク質発現、タンパク質変更状態、およびタンパク質の翻訳後修飾(リン酸化、ユビキチン化、メチル化、等) の変更。ここでは、単一の実験14,15,の諸条件の関数としてシグナル伝達の重要なコンポーネントの翻訳後修飾を調査する手段として抗体のアレイの有用性について述べる16。
リン抗体のアレイは区別信号伝達経路16の変化を分析して用いることができます。これらは、遺伝子組み換えや細胞キナーゼ阻害剤, 化学療法, グルコース欠乏、低酸素症、または血清飢餓によるストレスの治療から生じることができます。メモや特定の遺伝子、薬剤耐性やダウンレギュレーションもあります変更信号伝達経路17で。
薬剤耐性はたとえば、感度を避けるために薬剤標的の変異から生じる。肺癌の EGFR 遺伝子変異を特定のこを寄せつけないが、他の人に影響を受けやすいがんのレンダリング知られています。代替シグナル伝達経路突然変異17時にアクティブにできます。抵抗と低酸素症などに関与するシグナル伝達経路の同定のための広範なアプリケーション、としてリン抗体のアレイに、もっと洞察力を提供し、その結果の理解、メカニズムが関与しています。
蛋白質の修正の評価を可能にする技術は、頻繁に酵素や蛋白質間の物理的な相互作用の活性を調節することなどの規制の機能を提供するためにシステム生物学の重要なコンポーネントを表しています。翻訳後修飾の重要性は、ほぼすべて細胞外トリガー信号伝達経路18タンパク質リン酸化の役割によって示されています。従来、研究者は 1-5 ターゲットのみに興味がある場合は特に、キナーゼまたはタンパク質のリン酸化状態の識別を西部のしみの分析による特定でした。西部のしみは非常に選択的と事前の知識に向かってバイアスすることができ、結果として重要なターゲットを見逃す可能性があります。抗体アレイは、(例えば、ガラスまたは硝酸セルロース) 固体マトリックスにおける種々 のキャプチャ抗体[パンに固有のリン酸化 tyrosine(s)、抗ユビキチン等]を埋め込むことによって複数のターゲットの中の読み出しを提供します。二次抗体は、サンドイッチ ベース ELISA 形式 (図 1) で特定の蛋白質に関する情報を提供します。この試金なるより強力で適切な関心のある複数のターゲットまたは事前の知識は制限されている15。リン配列は、リン酸化として幅広いターゲット 1 つの実験でのタンパク質の一般的な金額を比較でき、質量分析法で大幅に改善された数量より広く即戦力です。この手法は、新規または未知のリン酸化部位の同定に適用されません。
大規模な質量分析を用いたプロテオミクスは、タンパク質19の特定のリン酸化サイトを識別するために用いることが可能します。この手法は、数千の翻訳後のイベントを列挙できる、高価な計測器、専用実験的パイプライン、およびほとんどの研究者の手が届かない計算の専門知識が必要です。
抗体のアレイは、様々 なタンパク質の読み出し16の同時読み出しを提供します。ユビキチン化タンパク質 (ユビキチン配列) のリン酸化に変更があります。このアレイ技術の主な利点は重要なセルのパラメーター (53 kDa、p53、チロシンキナーゼ受容体、細胞内のタンパク質) に関連付けられているさまざまな生物学的経路の生物学的状態に関する重要なフィードバックを提供すること同時に。さらに、例えばアポトーシスとユビキチン ・ リン酸化アッセイの浸透を高めるためさまざまな配列型を組み合わせることが可能です。場合の重要な利点の時間および費用有効方法で特定の機器や専門知識を必要としないいくつかのサンプルの様々 な翻訳後修飾変化を同時に評価するために複数のアレイを結合するこの能力は抗体アレイです。
多くの生物学的読み出しを組み合わせたアプローチは、実行の実験で細胞機械装置の本質的により正確な表現です。リン抗体のアレイの出現は、任意の単一蛋白質の変更状況よりもっと有益かもしれない変更のパターンの迅速な評価できます。リン抗体のアレイのアプリケーションの一般的なワークフローは、セリン、スレオニン、チロシンの変更に基づいています。この例は肺癌の治療抵?…
The authors have nothing to disclose.
ローレンス j. エリソン医学研究所の変革 USC (デビッド ・ アグスにギフト) の寛大な財政支援に感謝しております。秋ビーマーと生成につながるリサ Flashner の支援と本稿の出版感謝いたします。ローラ Ng は、彼女の管理のサポートを感謝いたします。
Odysee SA Imager | Li-Cor Biosciences | Fluorescent Imager | |
1.5 ml tube | Eppendorf | 22363212 | |
Cell Scraper | Falkon (Corning) | 353085 | |
Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | wash buffer for protein extraction |
Tissue Culture dish 100mm | TRP | 93100 | |
ICC Insulin syringe U100 | Becton Dickinson | 329412 | 27G5/8, 1ml for needle treatment of protein samples |
Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY003B | Human phospho MAPK array |
Protein Profiler ARRAY | R&D | ARY002B | Human phospho kinase array |
Centrifuge Eppendorf 5430R | Eppendorf | Table top centrifuge | |
Pierce BCA protein assay kit | Thermo Fisher | 23225 | |
SpectraMAX M2 | Molecular Devices | Absorbance reader for protein quantification | |
IRDye 800CW Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-32230 | Streptavidin conjugate for fluorescent detection |
LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet | NuAire | NU-425-400 | Tissue culture hood |
TC20 automated cell counter | Bio-Rad | 1450102 | Cell counter |
Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher | 78446 | |
RIPA buffer | Sigma | R0278 | |
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | F60 | sonicator |
Rocking platform shaker | VWR | 10860-780 | |
ImageJ | NIH open source | https://imagej.net/Welcome | |
SAS Institutie JMP® 12.1.0 (64-bit) | Microsoft |