Trædemølle bruger roterende bevægelse forsigtigt fremkalde øvelse i voksen Drosophila melanogaster ved at udnytte fluer medfødte, negative geotaxis. Det giver mulighed for analyse af samspillet mellem motion og faktorer, såsom genotype, sex, og kost og deres indvirkning på fysiologiske og molekylære analyser at vurdere metabolisk sundhed.
Forekomsten af komplekse metaboliske sygdomme er steget som følge af en udbredt overgang til livsstil øget kalorieindtag og nedsat aktivitetsniveau. Disse multifaktoriel sygdomme skyldes en kombination af genetiske, miljømæssige og adfærdsmæssige faktorer. En sådan kompleks sygdom er metabolisk syndrom (MetS), som er en klynge af metaboliske sygdomme, herunder hypertension, hyperglykæmi og abdominal fedme. Motion og kosten indgreb er de primære behandlinger anbefales af læger til at mindske fedme og dens efterfølgende metaboliske sygdomme. Motion indgreb, navnlig aerob intervaltræning, stimulerer gunstige ændringer i den fælles risikofaktorer for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), hjerte-kar-sygdom (CVD) og andre betingelser. Med tilstrømningen af beviser har der beskriver den terapeutiske effekt motion på metabolisk sundhed, om oprettelse af et system, der modeller øvelse i kontrollerede omgivelser giver et værdifuldt redskab til at vurdere virkningerne af motion i en eksperimentel sammenhæng. Drosophila melanogaster er et fantastisk værktøj for at undersøge de fysiologiske og molekylære ændringer, der skyldes motion intervention. Fluerne har kort levetid og lignende mekanismer af metaboliske næringsstoffer i forhold til mennesker. For at fremkalde øvelse i Drosophila, udviklede vi en maskine kaldet trædemølle, der udnytter den flue medfødte, negativ geotaxis tendens til at forsigtigt fremkalde klatring. Dette gør det muligt for forskere at udføre eksperimenter på store kohorter af genetisk forskellige fluer til bedre at forstå genotype-af-miljø interaktioner underliggende effekter af motion på metabolisk sundhed.
Barndom og voksen fedme voksende epidemier i kulturer, der forbruge højt kalorie kost og forbliver inaktiv i længere perioder, hvilket kan føre til alvorlige langsigtede konsekvenser, herunder insulinresistens, kronisk betændelse og slidgigt 1 , 2 , 3 , 4. forekomsten af disse lidelser fortsætter med at stige på grund af den voksende ubalance i kalorieindtag og udgifter tilskrives forhøjede forbrug af fedt og sukker og en primært stillesiddende livsstil5. Tilsvarende, denne energiubalance har ført til en stigning i tilfælde af Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) og hjerte-kar-sygdom (CVD)5. Enkeltpersoner er på et højere risiko for at udvikle begge lidelser, hvis de er blevet diagnosticeret med denne lidelse metabolisk syndrom (MetS), hvis symptomer omfatter abdominal fedme og dyslipidæmi2. MetS er formet af det komplekse samspil mellem genotype og forskellige miljømæssige faktorer, såsom kost og motion6. Derfor, for at få en fuld forståelse af de underliggende mekanismer for denne komplicerede sygdom, alle disse faktorer bør betragtes.
Når det kommer til bekæmpelse af MetS, anbefaler læger først gennemgår livsstilsændringer, der omfatter spiser en sund, velafbalanceret kost og fysisk aktivitet2,7,8. Da effektiv medicin er begrænset og gastrisk bypass-operation er dyre og kræver livslang medicinsk overvågning, anbefales farmakologiske og kirurgiske indgreb kun for alvorlige tilfælde og kun i kombination med disse ændringer i livsstil3 ,7,8. Mens livsstil interventioner, såsom motion og slankekure, kan producere og vedligeholde langsigtet vægttab mål, har brug for hvorvidt disse korrigerende foranstaltninger fuldt kan forbedre de negative virkninger forbundet med MetS yderligere undersøgelse7, 8.
Musemodeller har været brugt til at undersøge virkningerne af motion på metaboliske sygdomme i år; Men indførelsen af øvelse at flyve forskning på MetS er en forholdsvis ny bestræbelse9,10,11,12. Fluer giver den perfekte bil for at studere øvelse i kontrolleret laboratorium omgivelser, da de er lette at manipulere, har en kort levetid, er billig at vedligeholde, og energi-relaterede stofskifteveje er meget bevaret mellem Drosophila og mennesker13. D. melanogaster genomer er godt præget, og der findes et væld af genetik værktøjer til brug i Drosophila , der kan give indsigt i forskellige genotyper og genotype af miljø interaktioner, der kunne graduere den effekt af motion på kropsligt sundhed14.
Nuværende metoder for at udøve Drosophila påberåbe sig den flue medfødte, negativ geotaxis tendens, adfærdsmæssige instinkt til at kravle opad, at stimulere klatring i voksne inden for deres kabinetter11,12,15 . Power Tower, en metode til at stimulere øvelse i fluer, rejser systematisk flyve indhegninger lodret og derefter falder dem tilbage til bænken overflade, effektivt banke fluer til bunden af hætteglasset, således inducerende deres instinktive negative geotaxis 12 , 16. eksperimenter udført ved hjælp af denne maskine viste, at motion er en stærk beskyttende faktor mod mange alders-relaterede sygdomme, herunder CVD og T2DM, og fremmer sund aldring12,17,18 . Specifikt, viste de, at motion kan reducere udbrud af aldersrelaterede mobilitet tilbagegang i fluer og forbedre flere alders-relaterede symptomer, såsom hjerte ydeevne og stress respons17,18. Kontrol flyver dog aldrig placeret på tårnet viste højere klatring score end dem, der oplever den maskine, tyder på kraften af de gentagne dråber kan dræbes fluer og påvirker mobiliteten12. Dette tyder på, at en alternativ metode til inducerende øvelse, der er mindre kraftige og undgår forårsager fysiske traumer ville være en nyttig, supplerende metode til Power Tower protokol16.
For at forsigtigt fremkalde øvelse i Drosophila, udviklede vi en øvelse maskine kaldet trædemølle (figur 1). Trædemølle (herefter forkortet TW) roterende bevægelse udløser fluer medfødte, negativ geotaxis tendens af konstant omdefinere gravitationel toppen af hætteglas, som igen stimulerer klatring i fluer. I modsætning til andre metoder er den roterende bevægelse af TW i sagens natur blid, som minimerer antallet af supplerende stressfaktorer, der kan opstå og påvirke resultaterne. Således giver maskinen mulighed for at fremkalde øvelse i stort antal fluer uden inducerende stress, som vil sætte forskerne i at studere virkningerne af motion på metabolisk sundhed (figur 2), aldring, søvn og mange andre emner11.
Vores metode følger en invers pyramideformet, interval training protokol, som i vid udstrækning omfatter aspekter af aerobe intervaltræning (AIT) med nogle udholdenhed øvelse uddannelse. Den standard AIT regime er ændret i denne protokol til gradvist at øge varigheden af hvert interval over en fem-dages periode at fremme udholdenhed. AIT har været særligt nyttigt til at forhindre MetS i forhold til andre metoder, intervention og var mere effektiv til at vende metaboliske syndrom fælles risikofaktorer end løbende moderat motion19,20. En ulempe ved TW i forhold til Power Tower er imidlertid at fluer hurtigere habituate til den roterende bevægelse, således variation i medfødt tendens til habituate blandt fluer kan komplicere fortolkningen af fordelene ved motion. 11 en elegant løsning til denne begrænsning er beskrevet af Watanabe og gåde15 og deres supplerende artikel21.
Motion protokollen detaljeret her har vist sig at kunne stimulere blid motion i Drosophila og kan bruges til at simulere udholdenhedstræning i en kontrolleret laboratorium indstilling11. Det skal bemærkes, at når i første omgang at udvikle begrebet trædemølle, betragtes vi som kommercielle produkter, der kan redigeres for at udføre tilsvarende (f.eks., et laboratorium rotisserie). Men vi i sidste ende afvist denne tilgang, at vælge en specialbygget design, fordi den kommercielle udstyr ikke har en tilstrækkelig lav rotationshastighed (4 rpm) og manglede tilstrækkelig hætteglas kapacitet for høj overførselshastighed prøve generation.
Selve TW-protokollen kan justeres til at omfatte en bred vifte af forskningsemner. For eksempel kan justering hyppighed og varighed af fluer Motion regimer ændre intensiteten af arbejde-outs de modtager. Ved at udvide den protokol, der er længere end en uge eller til andre aldersgrupper, vil det være muligt at studere virkningerne af motion på ældning og forskellige alders-relaterede sygdomme. Vi anbefaler, hvis en udvidet øvelse tilgang er gennemført, derefter mindst en hviledag pr. uge bør føjes til recovery. Ydeevne og forbedring viste sig at være større i regimer, der omfattede et opsving end de regimer, der benyttes fortløbende daglige øvelse12. Også, ville vi advare mod udvidelse udøve bout længder sidste 30 min da tilvænning til den roterende bevægelse kan forekomme efter lange perioder med kontinuerlig udøve11. Vi har også observeret genetiske variationer i fluer motivation til at opretholde deres aktivitetsniveau på TW11. Således, hvis længere anfald er ønsket, overveje at overvåge fluer aktivitetsniveau, som blev forelagt af Watanabe og gåde15,21 beskriver deres ændring af begrebet TW. Andre faktorer, der kan varieres omfatter temperatur og søvn-vågner mønstre, der er vist også påvirke flyve bevægelser26,27.
Der er et væld af tilgængelige analyser under og efter protokollen afslutning at afhjælpe virkningerne af motion på den fysiologiske, adfærdsmæssige og molekylært niveau, såvel som potentialet til at optrævle epigenetiske effekter af motion. Yderligere metaboliske assays (f.eks. glukose, glykogen og protein), cardiac ydeevne og inflammatoriske respons foranstaltninger kan bruges til at udforske effekt motion har på flyve fysiologi og kroppens sammensætning12,14 ,24,28. Forskellige adfærdsmæssige ændringer forbundet med motion induktion, såsom ændringer i fodring adfærd, bevægeapparatet aktivitet og søvn, kan også måles ved hjælp af værktøjer som CAFE assay29 eller aktivitet overvågning enheder12,15 ,30. Ændringer i genekspression og cellulær respiration tilskrives motion kan også kvantificeres ved hjælp af metoder som qRT-PCR11 og respirometri31. Endelig har Drosophila værdifulde genetiske ressourcer til rådighed, såsom Drosophila genetik Reference Panel 2 og Drosophila syntetiske befolkning ressource, der giver forskere platform til at udføre kvantitative genetiske studier25,32. Disse værktøjer aktiverer kortlægning eksperimenter, såsom Genome-Wide Association studier og kvantitative træk Loci mapping til at identificere kandidat loci forbundet med motion og kost.
Undersøgelser udført ved hjælp af trædemølle viste, at gennemsnitligt motion nedsætter kropsvægt, samlede triglycerid opbevaring og glykogen, mens stigende proteinindhold og klatring ydeevne11. Derudover var der variabel svar til motion på tværs af køn og genotyper for kropsvægt, samt triglycerider, protein, glykogen, glukose og aktivitet niveauer11,15. Mens variabiliteten af svar til motion og kost på tværs af genotyper og sex kan være udfordrende at fortolke og til tider ulogisk, det afspejler kilderne til reelle biologiske variation observeret i naturlige populationer. Som vi bestræber os på at forstå mangfoldigheden af underliggende faktorer, der bidrager til de høje priser for MetS, vil værktøjer, der letter udrede den relative rolle af forskellige faktorer ved at teste disse faktorer i modelorganismer være afgørende for vores evne at udvikle personlige forebyggelse og behandling indgreb. For at fuldt ud for at vurdere effektiviteten af øvelsen, skal hver af disse faktorer og hvordan de interagerer anses for Hvornår gennemføre eksperimenter og udarbejdelsen af konklusioner.
TW, ligesom de fleste andre flyve træningsmaskiner, er begrænset i sin evne til at kvantificere flyve bevægelse. For nylig, Watanabe og gåde udviklet den roterende motion kvantificering systemet (HENV), en TW rygrad modificeret med en aktivitet overvågning enhed (LAM25H) fra Drosophila Monitoring System serie15,21. Ligesom TW, dette system bruger roterende bevægelse forsigtigt fremkalde motion samtidigt med at benytter LAM25H arm til at holde styr på og kvantificere flyve aktivitet, men det holder et mindre antal hætteglas (32 hætteglas) end TW15. For høj overførselshastighed motion undersøgelser, hvis aktivitet kvantificering ikke er nødvendige eller ønskede, tillader TW for en større prøvenummer. TW design kan også ændres fra sin nuværende form til at rumme et større antal hætteglas. Dette system, sammen med andre eksisterende motion metoder, bidraget til at fastslå at motion er ikke kun kan opnås i Drosophila men kan også undersøges for at fastslå effekten af fysisk aktivitet på en lang række fysiologiske og molekylær svar 11,12,15. Således, TW, som en gennemprøvet metode til inducerende blid motion i fluer, kan bruges til at sonde en lang række biologiske spørgsmål.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish og resten af Reed Lab for deres hjælp med flyve dyrehold og billedbehandling. Sean Mendez bygget den oprindelige trædemølle med bistand fra UAB Maskinværksted. Finansiering af denne undersøgelse blev leveret af NIH-R01 GM 098856 til LKR og bachelor kreativitet og forskning Academy på University of Alabama KEL og BJW.
Materials for TreadWheel Construction: | |||
Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount | McMaster-Carr | 60855K71 | Quantity: 4 |
Stainless Steel Ball Bearing | McMaster-Carr | 57155K306 | Quantity: 8 |
Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) | McMaster-Carr | 70235K16 | Quantity: 1 |
Compact Square-Face DC Gear motor | McMaster-Carr | 6409K23 | Quantity: 1 |
Tool Holder (clamps) | McMaster-Carr | 1723A22 | Quantity: 5 (10x) |
12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod | McMaster-Carr | 5227T24 | Quantity: 1 |
Set Screw Shaft Collar | McMaster-Carr | 6432K13 | Quantity: 8 |
Round-Belt Pulley | McMaster-Carr | 6284K51 | Quantity: 5 |
Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor | McMaster-Carr | 13DV 1A | Quantity: 1 |
Materials for Fly Maintenace and Husbandry | |||
6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) | Genesee Scientific | 32-130 | Quantity: 1 |
35x10mm Petri Dishes | VWR | 82050-536 | Quantity: 1 |
Narrow Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-116 | Quantity: 1 |
Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | Quantity: 1 |
Blowgun, Mini | Genesee Scientific | 54-104 | Quantity: 1 |
Materials for RING-like Assay: | |||
ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Quantity: 1 |
1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) | various | Quantity: 1 | |
digital camera with timer or smart phone with camera timer app | various | Quantity: 1 | |
Materials for Triglyceride Assay: | |||
Dewar Flask | VWR | 14200-960 | Quantity: 1 |
Serum Triglyceride Determination Kit | Sigma Aldrich | TRO100 | Quantity: 1 |
Cordless Pestle Motor | VWR | 47747-370 | Quantity: 1 |
Pestles | VWR | 47747-358 | Quantity: 1 |