Vi presenterar en teknik för kontaktlösa mikromanipulation av blåsor, använda lokaliserade kalcium Jon övertoningar. Mikroskop av en kalcium ion lösande, i närheten av en jätte lipid vesikler, används för att omforma lipid membranet, vilket resulterar i produktionen av membran tubulär utbuktningar.
I en mängd olika grundläggande cellprocesser vid exempelvis membran människohandel och apoptos, förekommer cellmembranet form övergångar samtidigt med lokala variationer i kalcium jonkoncentration. De viktigaste molekylära komponenterna som är engagerade i dessa processer har identifierats; dock särskilda samspelet mellan kalcium Jon övertoningar och lipider inom cellmembranet är betydligt mindre känd, främst på grund av den komplicerade karaktären av biologiska celler och difficultly av observation system. För att överbrygga denna klyfta, implementeras en syntetisk metod framgångsrikt för att avslöja lokaliserade effekten av kalciumjoner på cellmembranet härmar. Upprättandet av en härma för att likna villkor inom en cell är ett severalfold problem. Att fånga de fysiska egenskaperna hos celler krävs först en adekvat biomimetiska modell med lämpliga dimensioner och membran sammansättning. För det andra behövs en mikromanipulation setup att leverera en liten mängd av kalciumjoner till en viss aluminiummembran läge. Slutligen krävs ett system för observation för att upptäcka och registrera lipid membranet reagerar på yttre stimulering. Den här artikeln innehåller en detaljerad biomimetiska tillvägagångssätt för att studera kalcium Jon-membran samspelet, där en lipid vesikler system, bestående av en jätte unilamellar vesikler (GUV) ansluten till en multilamellar vesikler (MLV), utsätts för en lokaliserad kalcium gradient bildas med hjälp av ett Mikroskop system. Dynamiken i Joniska påverkan på membranet var observerade med fluorescensmikroskopi och inspelad på video bildhastighet. Till följd av membran stimulering, böjd mycket membran tubulär utbuktningar (Mbps) bildas inuti GUV, orienterade från membranet. Den beskrivna metoden inducerar ombyggnaden av lipid membranet och MTP produktion på ett helt kontaktlöst och kontrollerat sätt. Detta tillvägagångssätt introducerar ett sätt att hantera information om kalcium Jon-membran kontakter, ge nya vägar för att studera mekanismerna i cellmembranet omforma.
Rollen av kalciumjoner inom biologiska processer, särskilt deras deltagande i signalering, celldelning och membran fusion, är i fokus för många mekanistiska studier1. Den intracellulära cytoplasmatiska kalciumkoncentration ion är storleksordningen 100 nM, medan kalcium i organeller, såsom det endoplasmatiska nätverket, sekretoriska vesikler och mitokondrier, nå nivåer upp till tiotals millimolars i koncentration. Detta skapar branta kalcium Jon koncentration gradient storleksordningar över intracellulära membran2,3,4,5,6,7,8 ,9. Extracellulära kalcium ion är omkring 2 mM och därför variationer av kalcium jonkoncentration uppstå på båda extracellulära och intracellulära nivåer. Dessutom synkroniserade senaste studier styrker att intracellulära kalciumjon signalering händelser och neuronal aktivitet kan uppstå under de lokala fluktuationer av extracellulära kalcium jonkoncentrationer, om vikten av intra- och extracellulära kalcium Jon variationer10.
Som syftar till att förstå samspelet mellan kalciumjoner och biologiska membran, en syntetisk metod där infödda cellmembran ersätts med lipid lipidens blåsor har genomförts framgångsrikt. Utsätta blåsor till kalcium ion lösningar leder till förändringar i lipid huvud grupper och kolväte kedja packning, ökad membran spänningar, och vesikler aggregering, samt segregeringen av lipider och membran fas övergången11,12 ,13,14,15,16. Egenskaperna för lipid membranen vid exponering för kalciumjoner har undersökts med sådana experimentella tekniker som röntgen, 1H-NMR och spektroskopiska eller termodynamiska studier11,16, 17 , 18. i dessa studier membran sammansättning ofta trimmad för att likna infödda cellmembran och innehåller sådana fysiologiska lipider som fosfatidylkolin (PC) och fosfatidyletanolamin (PE) Fosfatidylserin (PS). PS är särskilt viktigt i konstgjorda vesikler förberedelse eftersom det är en viktig komponent i många cellulära processer inklusive intracellulära membran människohandel, exocytos och apoptos19,20.
Storleken på syntetiserade lipid blåsor varierar ofta från nanometer till flera mikrometer. Bland olika vesikler preparat, giant unilamellar blåsor (GUVs), som är flera tiotals mikrometer i diameter, är av särskild betydelse på grund av sin relativt stora storlek, lufttrafiktjänsten dimensionerna för enskilda celler21 , 22 , 23. den tillgängliga ytan av GUVs gör att effekten av lokala kemiska lutningar på membran biofysiska egenskaper studeras. Genom att exponera endast del av membran yta till de yttre stimuli, kan membran dynamiken undersökas närmare. Det har exempelvis visat att lokaliserade tillämpningen av kemiska eller pH lutningar på ytan av GUVs leder till bildandet av tubulär utskjutande delar, som inte observerats bulk exponering24,25. De observerade skillnaderna i membran beteende kräver ytterligare metodutveckling av singel-vesikler förhör för att få vissa insikter i mekanismerna i cellmembranet remodeling.
Bygger på metoderna för Mikroskop och mikromanipulation från tidigt 1900-tal26,27, i samband med nyare förfiningar av singel-vesikler manipulation system från 2000-talet23,28 , i denna artikel presenteras en strategi som membran remodeling och bildandet av membran tubulär utbuktningar (Mbps) i GUV membranet genereras som svar på lokala tillämpningen av kalciumjoner.
Vår strategi använder tredjeparts en vesikel komplex bestående av en chef som är ansluten till en multilamellar vesikler (MLV) som biomimetiska membran modellsystem (figur 1A). MLV krävs som en lipid reservoar för anläggningen leverera lipid material till GUV under exponering för kalcium Jon toning. Denna anslutning kan anläggningen att kompensera för ökningen av membran spänning under inducerad remodeling och forma övergången av GUV membranet och tillhandahålla lipider för MTP tillväxt. Dessutom underlättar MLV ytan immobilisering eftersom dess massa är större jämfört med det av GUV. GUV-MLV komplexen, när orörlig på ett fast substrat, har tidigare använts för att producera nanotube-vesikler nätverk, studera polymer-membran interaktion, härma sena stadier av exocytos29,30, 31,32,33.
Tidigare protokoll utnyttjas sojabönor polar lipid extrakt (SPE) för att förbereda GUV-MLV komplex28. SPE består av en blandning av fosfolipider som inkluderar PC (45,7%), PE (22,1%), fosfatidylinositol (PI, 18,4%), fosfatidsyror acid (PA, 6,9%), och en blandning av andra lipider (6,9%). I våra protokoll häri, SPE blandningen är dopad med 20% av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (natriumsalt) (DOPS) att efterlikna den inre bipacksedeln plasma cellmembranet. Ytterligare 1% av ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-knark) används för att färga de lipid lipidens aktivera övervakning av membran ombyggnaden med fluorescensmikroskopi. GUVs har symmetriska lipid sammansättning över lipidens och utsätts lokalt för 5 mM koncentrationer av kalciumklorid (CaCl2). Sådana experimentella förhållanden, med ett förhöjt kalcium jonkoncentration, härma också yttre membran bipacksedeln apoptotiska celler, där de PS molekylerna är uttryckta34. Bildandet av GUV-MLV komplexen kräver användning av en modifierad rehydrering-uttorkning metod som ursprungligen utvecklades av Criado och Keller35. Vesikler förberedelse protokollet innefattar bildandet av ett torrt lipidskikt, som sedan används för att bilda små blåsor i lösning. Denna lösning är då uttorkad och rehydrerad för att bilda de slutliga GUV-MLV komplex. Figur 2A -D illustrerar de viktigaste stegen för beredning av en typisk GUV-MLV komplex.
Efter vesikler preparatet har slutförts och den komplexa vesikler är orörlig på glassubstrat, används Mikroskop tekniken att leverera små mängder av kalciumjoner till den yttre bipacksedeln av GUV genom en öppen-tip glas mikropipett. Flödet av kalcium lösning ur spetsen genererar en lokaliserad kalcium Jon gradient GUV membran yta, vilket leder till membran remodeling och generering av Mbps. Mbps är inriktade bort kalcium Jon och växa inuti GUV. Denna MTP formation kan övervakas direkt med fluorescensmikroskopi och inspelade med en digitalkamera. Figur 3 visar de experiment som används för att producera den membran remodeling. Bildandet av Mbps (figur 2E och figur 4) i detta protokoll visar ett kontrasterande resultat för kalcium Jon exponering experiment utförs i bulk volym villkor. Under bulk förhållanden, GUVs brista och bildar membranet korrigeringsfiler som kan observeras för att följa glas yta25.
Ytterligare information om bildandet av GUV-MLV komplexen samt förfarandet för att utföra Mikroskop av kalciumjoner, förklaras i denna artikel. Protokollen är i hög grad fokuserat på kalcium Jon Mikroskop; Detta tillvägagångssätt kan dock enkelt ändras för användning i studera membran svaren på grund av lokala exponering för andra joner eller proteiner. Dessutom, kan sammansättningen av blåsor stämmas för att isolera rollerna lipid komponent i processen membran remodeling. Presenterade protokollet kräver inte någon sofistikerad utrustning för att producera GUV-MLV komplexen och kännetecknas av en hög grad av reproducerbarhet.
Biomimetiska cellsystem möjliggör studiet av membran beteende vid exponering för yttre stimuli som joner, proteiner eller nanopartiklar. GUVs, sådan en modell, kan svara på förändringar i den kemiska miljön genom att justera sin form, vilket ofta innebär bildandet av tubulära strukturer och invaginations24,41,42,43 .
Denna artikel erbjuder en metod för att generera Mbps på ett kontaktlöst sätt via omdaning av GUV ytan vid lokaliserade injektion av kalciumjoner GUV yta. Protokollet beskrivs utarbetandet av GUV-MLV komplexet, som härmar en cell plasmamembran, samt hur anställa en Mikroskop-teknik för att generera kalcium Jon övertoningar nära GUV yta att bilda Mbps. Majoriteten av tidigare experimentella studier som adresserat kalcium Jon-membran interaktioner utsatt lipid blåsor till bulk kalcium Jon koncentration14,17. Beroende på de experimentella förhållandena, kan sådana bulk exponering leda till olika membran svar med tubulär utskjutande delar bildade25.
Bildandet av GUV-MLV komplexen är ganska enkelt och kräver endast vanlig laboratorieutrustning, såsom en roterande indunstare, ultraljudsbad och vakuum exsickator. Fortfarande finns det flera kritiska steg att överväga under vesikler beredning. Det är viktigt att säkerställa att uttorkningen av blåsor är klar (under steg 2,3 i protokollet) och en torr cirkulär lipid film som innehåller endast en liten mängd salt kristaller bildas på ytan av glas täckglas. Under experimentet, använda färska lipid stamlösning i kloroform samt färska HEPES buffert, noggrann hantering av vesikler lösningen, är väsentliga för framgångsrik beredning av GUV-MLV komplexen. Säker fastsättning av GUV-MLV anläggningen till täckglas glasytan är dessutom avgörande för mikromanipulation och Mikroskop. För att bekräfta tillräcklig vidhäftning av den GUV-MLV komplex, mikropipett (utan injektion flöde) kan användas för tryck försiktigt mot GUV ytan. En fast klibbade vesikler kommer inte att glida längs ytan vid direkt fysisk kontakt. Eftersom experimenten utförs i en öppen buffert droplet, som kan förhöras i flera timmar, måste avdunstning beaktas. Avdunstning från buffert droplet-programmet kommer att ändra de osmotiska förhållanden, som kunde påverka och destabilisera blåsor. Återställa osmotiska förhållanden, återgår periodiska tillägg av rent vatten till provet att återställa den ursprungliga volymen systemet till homeostas.
När du ändrar lipid membranet sammansättning, är det avgörande att blåsor produceras i form av ett GUV-MLV komplex eftersom MLV möjliggör överföring av lipid materialet till GUV under den membran omforma. Tidigare studier har visat att ersätta komponenter i SPE blandningen med ren lipider, eller lägga till 5-30% av kolesterol, kan också för GUV-MLV komplexa bildande28,44. Majoriteten av de förberedda GUVs är unilamellar45.
Dessutom när du testar andra divalenta katjoner såsom magnesium joner, beror bildandet av Mbps tungt på närvaron av negativt laddade DOPS i lipid blandningen. Utan DOPS utgör inte Mbps i de blåsor som beskrivs i detta protokoll. Dessutom resulterar monovalenta katjoner såsom kalium och natrium, inte i bildandet av Mbps, även i DOPS-innehållande vesikler25.
Förutom de kritiska steg när det gäller förberedelser och manipulation av GUVs finns det flera viktiga faktorer att överväga under förfarandet för Mikroskop. Den framgångsrika Mikroskop av kalciumjoner är starkt beroende av väl fungerande glas Mikropipetter, som är beredda på dagen för experimentet. I området i närheten finns det flera faktorer som kan orsaka den mikropipett till funktionsfel. Den vanligaste orsaken är en igensatt tip öppning. Liten lipid partiklar, som är biprodukter av vesikler preparatet, sprids i lösningen och tenderar att följa mikropipett tipset, därmed generera en igensättning. Rengöring pipettspetsen görs bäst genom att lyfta upp från vesikler lösningen och placera det tillbaka nära GUV ytan. Användning av funktionen blowen-out av Mikroskop pumpen måste undvikas eftersom det leder till massiv injektion av kalciumjoner i bulk lösningen. Dessutom, små luftbubblor anhållna inuti mikropipett förhindra korrekt Mikroskop, i vilket fall mikropipett bör ersättas med en ny. Tips brott kan minimeras avsevärt genom att placera den experimentella setup på en vibrationsdämpande tabell att minimera tip svängningar.
Dessutom måste vidtas när du väljer en observation system, att minimera fotoblekning samtidigt få de bästa tiden-löst bilderna. Wide-fältet laserinducerad fluorescensmikroskopi utnyttjades i detta protokoll eftersom det möjliggör för en relativt hög bild förvärv på en objektiv begränsad sonden djup. Dessutom möjliggör användning av inverterad mikroskopi samtidiga Mikroskop och observationen av lipid blåsor och Mbps.
En av de viktigaste begränsningarna av den presenterade metoden krävs omfattande manuellt arbete och tillräckligt mikromanipulation färdigheter. Eftersom komplexen bildas genom en spontan svullnad, inte kan storleken på den GUVs och MLVs kontrolleras. Dessutom tillåter inte detta protokoll för kontroll av membran spänningen av de beredda GUV-MLV komplex, som kan vara nödvändigt att samla in ytterligare information när det gäller membran remodeling. GUVs är anslutna till MLVs med det sistnämnda levererande lipid materialet för betydande tillväxt av Mbps i en utsträckning som skulle vara omöjligt att uppnå enbart utnyttja tillgänglig från GUVs membranet. MLVs också bidra till att sänka laterala ytspänning variationer inom den GUV-MLV komplexa44som skulle komplicera försöken att styra spänningen av vesikler med mikropipett aspiration. Denna GUV-MLV-baserad modell ger en lägre spänning som bättre efterliknar de spänningar regimerna i cellulära membranstrukturer ansluten till membran reservoarer, såsom membran veck och invaginations46. Samtidigt, kan mikropipett aspiration tekniken användas framgångsrikt för att styra membranet spänningar i enstaka GUVs. Till exempel som arbetet av Graber et al. Detaljer på bildandet av membran tubulär invaginations i enda GUVs vid bindning av kalciumjoner membranet på bulk villkor från varierad spänning regimer40. Slutligen, jämförelse av membran beteendet på både lokal och bulk exponering för kalcium kräver bättre kontroll av membran vidhäftning till ytan, som är utanför ramen för detta protokoll.
För att sammanfatta, möjliggör föreslagna tekniken kontaktlös membran remodeling och bildandet av Mbps vid lokaliserade stimulering med kalciumjoner. Framtida tillämpningar av denna metod center på översättningen från syntetiska vesikler system till inhemska biologiska membran, såsom cell blebs. Den föreslagna metoden kan ingå med andra encelliga förhör system, såsom patch-clamp eller mikroelektrod amperometry, eller i kombination med lokaliserad uppvärmning strategier31,47,48. Testa effekten av andra joner eller molekyler är enkelt och innebär helt enkelt ersätta kalciumjonerna med molekylarna av intresse. Dessutom kan komplexa syntetiska lipid blåsor produceras genom membran funktionalisering med transmembrana proteiner, som kan utöka vår förståelse av biofysisk cell omforma och cellmembranet dynamics är associerad med avkänning av lokala kemiska gradienter. Sist men inte minst, kontaktlösa stimulering av lipid membranet kan också översättas till polymera mjuk materia system, som erbjuder en grund för en roman kontaktlösa manipulation plattform.
Soy bean polar lipid extract | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
541602C | 100 mg |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS | Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA) |
840035C | 1×25 mg |
ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | ATTO-TEC (Germany) | AD 488-31 | 1 mg |
Hamilton syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25 μL, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51 mm (2 in.) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 20735 SIGMA-ALDRICH | |
Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10×75 mm, Borosilicate glass 250/pack | Corning Incorporated (Corning, NY 14831) | 99445-10 | |
Chloroform CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, contains amylenes as stabilizer | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 650498-1L-D | |
Rotary evaporator | Büchi Rotavapor R-144 Switzerland | ||
Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm | KEBO lab (Sweden) | MA00360500 | |
Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO | Sharlau Chemie S.A. (Spain) | P9333-500G | |
Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | S7653-1KG | |
Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | G5516-1L | |
Glycerol, for molecular biology, minimum 99% | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | T-1503 2050 g | |
Trizma base | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5629-500G | |
Potassium phosphate tribasic (K3PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | P5655 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 5886 | |
MgSO4 | Merck (USA) | 34549-100 g | |
EDTA | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | H0887 Sigma | |
HEPES solution 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | Z260282-1PAK | 24×60 mm |
Acrodisc syringe filters, PVDF membrane, diam. 13 mm, pore size 0.2 μm | Sigma Aldrich (Missouri, USA) | 631-1339 | |
Menzel Gläzer #1, glass cover slip | VWR (USA) | ||
Diaphragm vacuum pump for the desiccator | Vacuubrand (Germany) | ||
Ultrasonicate bath | Bandelin Sonolex (Germany) | ||
VX-100 Lab vortexer vortex mixer | Labnet International (USA) | ||
488 nm laser line | Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden) | ||
Leica Microsystems immersion oil for microscopes | Leica (Germany) | 12847995 | |
Inverted fluorescence microscopy system | Leica DM IRB (Wetzlar, Germany) | ||
Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision) | Technologies GmbH (Thuringia, Germany) | 300038 | |
PatchStar Micromanipulator | Scientifica (Uckfield, UK) | 612-7933 | |
Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10, 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D. | Harvard Apparatus U.K | ||
Eppendorf microloader (pipette tips) | VWR (USA) | ||
P-2000 CO2 laser-puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | ||
Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet | Eppendorf (Germany) |