בידול, תחזוקה, וניתוח תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית אנושי: מודל המחלה-ב--תבשיל BEST1 מוטציות
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להבדיל תאים (RPE) אפיתל הפיגמנט ברשתית תאי גזע pluripotent האנושי הנושאים מוטציות נגזר החולה. הקווים המוטנטים תא עשוי לשמש עבור ניתוחים פונקציונליים כולל immunoblotting, immunofluorescence, תיקון קלאמפ. גישה זו מחלה-ב–תבשיל עוקף את הקושי של השגת תאי RPE אדם מקורי.
Abstract
למרות מעל 200 מוטציות גנטיות הגן האנושי BEST1 מזוהה, קשורה מחלות ניווניות של הרשתית, המנגנונים פתולוגיים נשארים חמקמק בעיקר בשל היעדר מודל טוב ויוו ללמוד BEST1 מוטציות שלה בתנאים פיזיולוגיים. BEST1 מקודד ערוץ יון, כלומר BESTROPHIN1 (BEST1), אשר מתפקד באפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE); עם זאת, הנגישות מוגבלת מאוד מקורית תאי RPE אדם מייצג אתגר למחקר מדעי. פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור אנושי RPEs הנושאת BEST1 גורמי מחלות מוטציות על ידי בידול המושרה מתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs). כפי hPSCs עצמית מתחדשת, גישה זו מאפשר לחוקרים יש מקור יציב של hPSC-RPEs עבור ניתוח ניסיוני שונים, כגון immunoblotting, immunofluorescence, תיקון קלאמפ, ובכך מספק מודל המחלה-ב–מאכל חזק מאוד BEST1-הקשורים לתנאי ברשתית. ראוי לציין, אסטרטגיה זו ניתן להחיל ללמוד פיזיולוגיה RPE (פתו) ו אחרות הגנים של עניין הביעו באופן מקורי ב- RPE.
Introduction
זה תועד כי לפחות חמישה מחלות ניווניות ברשתית נגרמות על ידי מוטציות גנטיות BEST1 ג’ין1,2,3,4,5,6 , 7 , 8, עם המספר של מוטציות שדווחה כבר מעל 200, הגדלת עדיין. אלה BEST1-הקשורים במחלות, הידוע גם בשם bestrophinopathies, לגרום אובדן ראייה מתקדמת ועיוורון אפילו, ויש כיום אין טיפולים יעילים. המוצר חלבון של BEST1, כלומר BESTROPHIN1 (BEST1), היא Ca2 +-מופעל ערוץ Cl– (CaCC) במיוחד לידי ביטוי אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE) של העיניים5,6, 8,9. חשוב, פנוטיפ קליני של BEST1-מחלות המשויך הוא התגובה חזותי מופחתת לגירויים קלים, שנקרא שיא אור (LP) נמדד10,‘ electrooculogram ‘11; LP הוא האמין בתיווכו CaCC RPE12,13,14. על מנת להבין טוב יותר את המנגנונים פתולוגי של מוטציות BEST1 , לפעול לקראת טיפולים פוטנציאליים, זה חיוני ללמוד מוטציה ערוצי BEST1 endogenously לידי ביטוי תאי RPE אדם.
עם זאת, קבלת RPE תאים ישירות מחולים חיים אינה מעשית מאוד. למרות תאי RPE יליד ובביצים ביופסיות של גופות אדם, העוברים, הנגישות המקורות הללו קשה מגבילה באופן משמעותי מחקר מדעי. לכן חשוב וקריטי. שיהיה מקורות חלופיים RPE מלבד העיניים האנושיות. שיחה זו נענתה על ידי הפיתוחים האחרונים בתחום תאי הגזע טכניקות, כמו תאי RPE פונקציונלי עכשיו ניתן להבחין מן האדם גזע pluripotent (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים (hESCs) ואת המושרה גזע pluripotent (hiPSCs), האחרון שיוצר התכנות fibroblasts העור העיקרי של תורמים16,17,18. חשוב, התחדשות עצמית pluripotency של hPSCs על מנת להבטיח מקור אמין כדי ליצור RPEs, בעוד המטופל-יחודיות של hiPSCs ופוטנציאל השינוי גנומית של hESCs (למשל, על-ידי CRISPR) מציעים מודל המחלה-ב–תבשיל רב-תכליתי עבור מוטציות BEST1 הרצוי.
hPSC-RPE יש כמה יתרונות על פני עכברים RPE מודלים: 1) עכברים knockout BEST1 אינם מציגים כל סטייה ברשתית19, מעלים את האפשרות של דרישה גנטית שונה של BEST1 ב RPE בין בעכברים ובבני אדם; 2) יש רק 3% של תאי RPE אדם binucleate, לעומת 35% בעוד עכברים20; 3) hiPSC-RPE potentiates עצמיים השתלת ב קליניים לטיפול רשתית הפרעות21. בכל זאת, בבעלי חיים הם עדיין חיוני ללמוד RPE פיזיולוגיה, פתולוגיה במערכת בשידור חי, הפוטנציאל oncogenic של hiPSC. אי אפשר להתעלם.
ההליך פה מתאר של hPSC יעיל ופשוט למדי לפרוטוקול בידול RPE יכול לשמש למטרות מחקר ומטרות קליניים. פרוטוקול זה משתמש nicotinamide (ויטמין B3) כדי להגדיל את הבידול של hPSCs על רקמה עצבית, אשר בהמשך הנגרמת להבדיל לתוך RPE על ידי טיפול עם activin-א טיפול Nicotinamide הוכח להגדיל את מספר תאי פיגמנט (סימן של בידול לתוך RPE), ואולי על-ידי attenuating הפעילות אפופטוטיים להיפגע להבדיל תאים22. התאים hPSC-RPE וכתוצאה מכך מציגים את סמני מפתח אותו, מורפולוגיה המרוצף והפונקציונליות הסלולר יליד האנושי RPE תאים22. לפיכך, בסביבה מחקר, התאים hPSC-RPE וכתוצאה מכך מתאימים לפי הזרם ניתוחים פונקציונליים כולל immunoblotting, immunostaining, תיקון שלם-תא קלאמפ, שעבורו הליכים ניסיוני מפורטים ניתנים גם. קלינית, תאי RPE שמקורם בתאי גזע הראו פוטנציאל גדול לטיפול השתלת של ניוון מקולרי מחקרים שנעשו בבעלי חיים והן בניסויים בבני אדם23.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההליך החשוב ביותר עבור הגישה המחלה-ב–מאכל הוא להבדיל hPSCs עם מוטציה גורמי מחלות לשושלת התא הנכון, אשר RPE עבור BEST1. לפיכך, לאחר ניסוי בידול, התאים hPSC-RPE שנוצר בקפידה לאמת על מעמדם בוגר ספציפי RPE מורפולוגיות, חלבון סמני16,17,18. כדי למזער את החפ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מומן על ידי מענקים NIH EY025290, GM127652, אוניברסיטת רוצ’סטר סטארט-אפ מימון.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
