التمايز، والصيانة، وتحليل خلايا ظهارة صباغ الشبكية البشرية: نموذج المرض في طبق للطفرات BEST1
Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتفريق بين خلايا ظهارة (RPE) صباغ الشبكية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية إذ تضع الطفرات المستمدة من المريض. يمكن استخدام خطوط الخلية متحولة للتحليلات الفنية بما في ذلك إيمونوبلوتينج، الفلورة والمشبك التصحيح. هذا المرض في طبق النهج تلتف إلى صعوبة الحصول على خلايا RPE الإنسان الأصلي.
Abstract
على الرغم من أن ما يزيد على 200 الطفرات الوراثية في الجينات البشرية BEST1 التي تم تحديدها والمرتبطة بالأمراض التنكسية الشبكية، الآليات المرضية التي لا تزال بعيدة المنال يرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود نموذج جيد في فيفو لدراسة BEST1 والطفرات في ظل الظروف الفسيولوجية. BEST1 ترميز قناة أيون، هما BESTROPHIN1 (BEST1)، الذي يعمل في ظهارة صباغ الشبكية (RPE)؛ ومع ذلك، إمكانية وصول محدودة للغاية للخلايا RPE البشرية الأصلية يمثل تحديا رئيسيا للبحوث العلمية. ويصف هذا البروتوكول كيفية توليد الرؤى البشرية تحمل BEST1 الطفرات المسببة للمرض بالتمايز المتعمد من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). كما هبسكس قابلة للتجديد الذاتي، هذا النهج يسمح للباحثين أن يكون مصدر ثابت للرؤى هبسك للتحليلات التجريبية المختلفة، مثل إيمونوبلوتينج، الفلورة والمشبك التصحيح، ومن ثم يوفر نموذج المرض في صحن قوية جداً BEST1-ترتبط شروط الشبكية. جدير بالذكر أن هذه الاستراتيجية يمكن تطبيقها على دراسة فسيولوجيا RPE (مرضية) وجينات أخرى تهم أصلاً المعرب عنها في RPE.
Introduction
وقد تم توثيق خمسة على الأقل من الأمراض التنكسية الشبكية الناتجة عن الطفرات الوراثية في BEST1 الجينات1،2،3،4،،من56 , 7 , 8، مع عدد الطفرات المبلغ عنها مسبقاً على 200 وآخذة في الازدياد. هذه BEST1-الأمراض المرتبطة بها، ويعرف أيضا باسم بيستروفينوباثيس، تسبب فقدان البصر التدريجي وحتى العمى، ولا يوجد حاليا لا علاجات فعالة. البروتين المنتج من BEST1، هما BESTROPHIN1 (BEST1)، هو Ca2 +-تنشيط Cl– قناة (كاكك) على وجه التحديد المعرب عنها في ظهارة صباغ الشبكية (RPE) لعيون5،6، 8،9. الأهم من ذلك النمط الظاهري سريرية من BEST1-الأمراض المرتبطة بها هي انخفاض الاستجابة البصرية للمنبهات الخفيفة، تسمى ذروة الخفيفة (ليرة لبنانية) تقاس في10،اليكتروكولوجرام11؛ ويعتقد أن يكون توسط كاكك في RPE12،،من1314ليرة لبنانية. من أجل فهم أفضل الآليات المرضية للطفرات BEST1 والعمل من أجل العلاج المحتملة، من الضروري دراسة قنوات BEST1 متحولة وأعربت عن اندوجينوسلي في الخلايا البشرية RPE.
ومع ذلك، الحصول على RPE الخلايا مباشرة من المرضى يعيش عملي جداً. على الرغم من أن يمكن حصادها الأصلية RPE الخلايا من خزعات من الجثث البشرية والأجنة، يحد صعوبة إمكانية الوصول إلى هذه المصادر بشكل كبير البحث العلمي. ولذلك من المهم أن يكون البديل RPE مصادر أخرى بخلاف العين البشرية. تمت الإجابة هذه الدعوة بالتطورات الأخيرة في تقنيات الخلايا الجذعية، كما الوظيفية RPE الخلايا الآن يمكن أن تكون متباينة من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (هيسكس) والتي يتسبب فيها الخلايا الجذعية pluripotent (هيبسكس)، هذا الأخير يتم إنشاؤها بواسطة إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلد الأولية من المانحين16،،من1718. الأهم من ذلك، ضمان التجديد الذاتي وبلوريبوتينسي من هبسكس مصدر موثوق لتوليد الرؤى، بينما المريض-خصوصية هيبسكس وإمكانية تعديل الجينوم هيسكس (مثلاً، قبل كريسبر) تقدم نموذجا للمرض في صحن تنوعاً المطلوب BEST1 الطفرات.
هبسك-RPE مزايا عديدة على الفئران نماذج RPE: 1) لا تعرض الفئران خروج المغلوب BEST1 أي شذوذ الشبكية19، زيادة إمكانية اشتراط BEST1 في RPE الوراثية المختلفة بين الفئران والبشر؛ 2) سوى 3 في المائة خلايا RPE البشرية بينوكليتي، مقابل 35 في المائة في20من الفئران؛ 3) هيبسك-RPE يقوي التي تعالج الزرع الذاتي في السريرية المعالجة الشبكية واضطرابات21. ومع ذلك، نماذج حيوانية لا يزال أمرا لا غنى عنه لدراسة RPE علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في نظام العيش، ولا يمكن إغفال احتمال النمطان من هيبسك.
يصف الإجراء هنا هبسك مفيدة وبسيطة معتدلة RPE التمايز البروتوكول التي يمكن استخدامها لأغراض السريرية والبحوث. هذا البروتوكول يستخدم نيكوتيناميد (فيتامين B3) لزيادة تمايز هبسكس للأنسجة العصبية، وكذلك فعل التفريق في RPE بالمعاملة مع أضافت-ألف. العلاج نيكوتيناميد قد ثبت لزيادة عدد الخلايا المصطبغة (علامة التمايز في RPE)، ربما بتخفيف النشاط apoptotic للتفريق بين الخلايا22. تعرض الخلايا RPE هبسك الناتجة نفس علامات رئيسية ومورفولوجيا حصاة كبيرة ووظيفة الخلوية ك خلايا RPE البشرية الأصلية22. وهكذا، في إعداد بحوث، RPE هبسك الخلايا الناتجة مناسبة للتحليلات الفنية المتلقين للمعلومات بما في ذلك إيمونوبلوتينج، إيمونوستينينج، والمشبك تصحيح كامل الخلية، التي تتوفر أيضا إجراءات تجريبية مفصلة. سريرياً، RPE الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية أظهرت إمكانات كبيرة لزرع الأعضاء معاملة البقعي في دراسات أجريت على الحيوانات والتجارب البشرية23.
Protocol
Representative Results
Discussion
هو الإجراء الأكثر أهمية للمرض في طبق النهج التفريق بين هبسكس مع طفرة المسببة للمرض إلى نسب الخلية الصحيحة، وهو RPE ل BEST1. وهكذا، بعد كل تجربة التمايز، RPE هبسك الخلايا الناتجة ينبغي بعناية المصادقة لوضعهم ناضجة مورفولوجيس RPE على حدة والبروتين علامات16،،من<sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا المشروع من المعاهد الوطنية للصحة منح EY025290، GM127652، وجامعة روتشستر بدء التمويل.
Materials
| Knock-Out (KO) DMEM | ThermoFisher | 10829018 | |
| KO serum replacement | ThermoFisher | 10829028 | |
| Nonessential amino acids | ThermoFisher | 11140050 | |
| Glutamine | ThermoFisher | 35050061 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human activin-A | PeproTech | 120-14 | |
| MEM (a modification) | Sigma-Aldrich | M4526 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| N1 supplement | Sigma-Aldrich | N6530 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | G1146 | |
| Nonessential amino acids | Sigma-Aldrich | M7156 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0386 | |
| Triiodo-thyronin | Sigma-Aldrich | T5516 | |
| mTeSR-1 medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| Collagenase | Gibco | 17104019 | |
| Trypsin | VWR | 45000-664 | |
| M-PER mammalian protein extraction reagent | Pierce | 78501 | |
| proteinase inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| RPE65 antibody | Novus Biologicals | NB100-355 | |
| CRALBP antibody | Abcam | ab15051 | |
| BEST1 antibody | Novus Biologicals | NB300-164 | |
| Beta Actin antibody | ThermoFisher | MA5-15739 | |
| Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG | ThermoFisher | A-21202 | |
| Goat anti-mouse IgG | ThermoFisher | SA5-35521 | |
| Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-68071 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher | 62249 | |
| HEKA EPC10 patch clamp amplifier | Warner Instruments | 895000 | |
| Patchmaster | Warner Instruments | 895040 |
References
- Allikmets, R., et al. Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies. Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).
- Burgess, R., et al. Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans. Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).
- Davidson, A. E., et al. Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).
- Kramer, F., et al. Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration. Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).
- Marquardt, A., et al. Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best’s disease). Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).
- Petrukhin, K., et al. Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy. Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).
- Yardley, J., et al. Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC). Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).
- Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies. Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).
- Marmorstein, A. D., et al. Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).
- Boon, C. J., et al. The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).
- Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. Functional roles of bestrophins in ocular epithelia. Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).
- Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium. Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane. J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).
- Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation. J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).
- Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines. Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).
- Milenkovic, A., et al. Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).
- Moshfegh, Y., et al. BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE. Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).
- Li, Y., et al. Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1’s essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE. Elife. 6, (2017).
- Marmorstein, L. Y., et al. The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1). J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).
- Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula. PLoS One. 10 (4), e0125631 (2015).
- Kamao, H., et al. Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application. Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).
- Idelson, M., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).
- Mandai, M., et al. Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration. N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
- Maruotti, J., et al. A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).
- Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers. Nat Commun. 4, 2540 (2013).
- Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).
- Yang, T., et al. Structure and selectivity in bestrophin ion channels. Science. 346 (6207), 355-359 (2014).
- Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels. PLoS One. 7 (5), e37079 (2012).
- Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels. Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).
- Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase. J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).
- Gong, J., et al. Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate. PLoS One. 10 (11), e0143272 (2015).
- Zhang, Y., et al. ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction. Nat Commun. 9 (1), 3126 (2018).
